絞股藍總苷分散片中絞股藍皂苷A含量測定*

徐文峰，金鵬飛，徐碩，鄺詠梅，何笑榮

(北京醫(yī)院藥學部國家老年醫(yī)學中心，藥物臨床風險與個體化應(yīng)用評價北京市重點實驗室，北京 100730)

絞股藍為葫蘆科絞股藍屬植物，具有清肺化痰、補氣生津、健脾安神等功效[1]，其化學成分復(fù)雜，主要包括皂苷類[2-3]、多糖類[4-5]、黃酮類[6-7]、氨基酸[8-9]、微量元素[10-11]等多種成分，主要活性成分為皂苷類[12]?，F(xiàn)代藥理研究表明絞股藍具有降血脂、抗動脈粥樣硬化等作用[13]。分散片具有分散狀態(tài)佳、崩解時間短、藥物溶出迅速、吸收快、生物利用度高等特點[14]。絞股藍總苷分散片臨床主要用于高脂血癥等的治療。達瑪烷型皂苷類成分絞股藍皂苷A是絞股藍中含量較高且有效的單體成分[15]。筆者在本研究建立高效液相色譜法測定絞股藍總苷分散片中絞股藍皂苷A含量，報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260液相色譜(配有G1311C型四元梯度泵，G1329B型自動進樣器，G1316A型柱溫箱，G4212B 型DAD檢測器；Agilent Technologies，美國)；XP-205電子天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)；KQ-800KDE超聲儀(中國昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore)。

1.2試藥 乙腈(色譜純，批號：165741，美國Fisher公司)；實驗室用水為超純水；絞股藍皂苷A對照品(批號：drk-1392-911223，成都德銳可生物科技有限公司，含量：98.0%)；人參皂苷Rb1(批號：110704-200318)，人參皂苷Rb3(批號：111686-200501)，人參皂苷Rg1(批號：110703-200424)，人參皂苷Rd(批號：111818-201603)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；絞股藍總苷分散片(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號：160702，160901，161101，規(guī)格：每片含絞股藍總苷60 mg)；羥丙基纖維素(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20151020)；羧甲基淀粉鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150311)；硬脂酸鎂(營口市第二制藥廠生產(chǎn)，北京市燕京制藥廠分裝，批號：20000609)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Alltima C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(31：69)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長210 nm；進樣體積：20 μL；柱溫為30 ℃。樣品進樣前均經(jīng)過孔徑0.22 μm尼龍濾膜濾過。

2.2對照品溶液的制備 取絞股藍皂苷A對照品16.5 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為絞股藍皂苷A儲備液(0.33 mg·mL-1)。精密量取絞股藍皂苷A儲備液1，2，3，4，5 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋成濃度約為33，66，99，132，165 μg·mL-1的絞股藍皂苷A對照品溶液。中間濃度的對照品溶液用作含量測定。

2.3供試品溶液及陰性對照溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取粉末適量(相當于絞股藍總苷40 mg)，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min，甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別稱取藥品說明書中記錄的輔料羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂各0.1 g，置于10 mL量瓶中，同法操作，配制不含絞股藍總苷的陰性對照溶液，用于專屬性實驗。

2.4專屬性實驗和系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 分別進樣分析陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液，結(jié)果見圖1，樣品中其他成分和制劑輔料不干擾絞股藍皂苷A的測定。理論板數(shù)按絞股藍皂苷A計算不低于3000。供試品溶液中主峰純度檢測閾值設(shè)定為990，應(yīng)符合規(guī)定。

2.5線性關(guān)系考察 取“2.2”項對照品溶液分別進樣，記錄色譜圖，以濃度(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸。得到線性方程為Y=6.31X-7.95，r=1.000 0，說明絞股藍皂苷A濃度在32.69～ 163.46 μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈良好線性相關(guān)。將對照品溶液逐級稀釋，在信噪比(S/N)約為10.0時測得定量限為0.098 μg·mL-1，在S/N約為3.0時測得檢測限為0.033 μg·mL-1。

2.6精密度和穩(wěn)定性實驗 取中間濃度的對照品溶液連續(xù)進樣6次，記錄絞股藍皂苷A峰面積，峰面積的RSD為0.36%(n=6)，說明儀器精密度良好。對供試品溶液(批號：160702)分別于0，2，4，8，12，24 h進樣分析，峰面積的RSD為0.85%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性實驗 取絞股藍總苷分散片(批號：160702)制備供試品溶液6份，分別進樣分析，計算得到絞股藍皂苷A含量，含量的RSD為1.9%(n=6)，說明方法的重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率實驗 精密稱取樣品(批號：160702，平均片質(zhì)量為0.465 6 g)粉末6份，分別精密加入絞股藍皂苷A儲備液1.5 mL，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制得各加樣供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率和RSD，結(jié)果平均回收率為97.2%，RSD=1.5%。見表1。

2.9樣品含量測定 應(yīng)用本文建立的方法對3批絞股藍總苷分散片進行測定，每個樣品制備3份，取平均值，測得批號為160702，160901，161101的樣品中絞股藍皂苷A的含量分別為4.05，3.88和3.21 mg·g-1，說明絞股藍總苷分散片生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。

1.絞股藍皂苷A

表1 絞股藍皂苷A加樣回收實驗結(jié)果

3 討論

3.1檢測波長的選擇 取絞股藍皂苷A的對照品溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)進行全波長紫外光譜掃描，結(jié)果顯示絞股藍皂苷A呈現(xiàn)末端吸收，故選用210 nm作為絞股藍皂苷A的檢測波長。

3.2提取方式的選擇 分別考察60%甲醇溶液、80%甲醇溶液以及甲醇作為提取溶劑時提取效率，結(jié)果表明，甲醇的提取效率最高，故選擇甲醇為提取溶劑；提取時間分別考察超聲10，20和30 min，結(jié)果表明超聲提取10 min即可將樣品中絞股藍皂苷A提取完全。

3.3流動相的選擇 參考文獻[16-20]，考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等不同流動相，發(fā)現(xiàn)以甲醇作為有機相時基線漂移相對嚴重，末端吸收干擾較強；以乙腈作為有機相時基線相對平穩(wěn)，分離效果好，在水相中加入磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值，則對絞股藍皂苷A的峰型影響不大，所以選擇乙腈-水為流動相。

3.4專屬性實驗 本實驗考察絞股藍總皂苷中已有含量測定研究報道的皂苷類成分，對絞股藍皂苷A含量測定的干擾，在本實驗條件下，絞股藍皂苷A與人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd的分離度均大于1.5，說明上述成分不會干擾絞股藍皂苷A的含量測定。

本實驗采用高效液相色譜法建立絞股藍總苷分散片中有效成分絞股藍皂苷A含量測定方法，該方法操作簡便，結(jié)果準確可靠，可為絞股藍總苷分散片以及含有絞股藍總皂苷的其他制劑的質(zhì)量控制提供參考。