一株桑椹菌核病生防菌分離鑒定及其拮抗作用分析

朱志賢，于翠，李勇，莫榮利，鄧文，胡興明

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，湖北武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院，湖北武漢 430064)

果桑是以產(chǎn)果為主、果葉兼用型桑樹的統(tǒng)稱。其果實桑椹具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值，花青素含量極高，抗氧化功效明顯，具有促進造血細胞生長、降血糖、降血脂等藥理作用，被原衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”名單[1-2]。桑椹除直接食用外，目前已開發(fā)出果汁飲品、桑果酒、桑果醬、桑椹膏及花青素等產(chǎn)品，表現(xiàn)出巨大的產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景[3]。然而在果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，桑椹菌核病來勢猛、發(fā)病快，發(fā)病率高達30%～90%，有些果桑園甚至絕產(chǎn)[4]，桑椹菌核病已成為限制果桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。

桑椹菌核病又稱白果病，目前公認且常見的菌核病有桑椹肥大型菌核病、桑椹縮小型菌核病和桑椹小粒型菌核病3 種，病原菌分別為桑實杯盤菌Ciboria shiraiana、桑椹核地杖菌Scleromitrula shiraiana和肉阜狀杯盤菌Ciboria carunculoides[5-8]。除上述病原菌外，王國良 等在寧波地區(qū)還發(fā)現(xiàn)了Scleromitrulasp.、Scleromitrula rubicola和Synciboria ningpoensis等桑椹菌核病菌[9]；賀磊 等報道了桑莖點霉Phoma moricola同樣可以引發(fā)桑椹菌核病，且其病果形態(tài)與桑椹肥大型菌核病頗為相似[10]；胡軍歡 等在寧波天宮莊園桑果基地發(fā)現(xiàn)核盤菌Sclerotinia sclerotiorum也能導致桑椹菌核病[11]。所有報道的病原菌中，由C.shiraiana引起的桑樹肥大型菌核病在亞洲分布最廣泛[4，9，12]。

目前生產(chǎn)上防治桑椹菌核病主要靠化學藥劑防治。常用藥劑有70%甲基托布津和50%多菌靈，兩者均為單作用位點的內(nèi)吸性殺菌劑，大量濫用后，病原菌很容易產(chǎn)生抗藥性，己報道多菌靈在多種作物防治上產(chǎn)生了抗藥性[13]；而且農(nóng)藥殘留還會引發(fā)食品安全、環(huán)境污染等問題。一些農(nóng)業(yè)措施如清除病枝病果、合理栽植、深翻土壤、合理施肥、覆蓋地膜等，可一定程度減輕病害發(fā)生，但不能從根本上控制病害。利用有益微生物防治桑椹菌核病可以維持生態(tài)環(huán)境平衡，是一種安全有效措施，逐漸受到人們重視。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些對桑椹菌核病菌具有拮抗作用的微生物，如蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis、腸桿菌Enterobactersp.、哈茨木霉Trichoderma harzianum、棘孢木霉Trichoderma asperellum等[12，14-15]，但是不同拮抗微生物的應用范圍各有其局限性，因此篩選更多更有效的拮抗微生物尤為重要。已報道應用于桑椹菌核病生物防治的生防菌以芽孢桿菌為主，脂肽類化合物是芽孢桿菌產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)，可劃分為表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和豐原素(Fengycin)3 大類。其中Surfactin的分泌利于細菌定殖，Iturin 和Fengycin 具有較強抑制真菌菌絲生長的作用。目前報道芽孢桿菌脂肽類化合物的功能基因主要有srfAA、srfAB、bmyB、fenD、bioA和ituC等[16]。筆者從健康桑椹中分離獲得一株對桑椹菌核病菌具有拮抗活性的內(nèi)生菌，對其進行抑菌譜測定和分類鑒定，并對其發(fā)酵濃濾液的性質(zhì)及拮抗機理進行初步研究，以期為桑椹菌核病的生物防治提供有應用價值的生防菌株。

1 材料與方法

1.1 抑菌譜測定靶標菌株 桑椹核地杖菌分離自湖北宜昌市三斗坪鎮(zhèn)采集的桑椹菌核病病果，肉阜狀杯盤菌分離自湖北恩施市龍鳳鎮(zhèn)采集的桑椹菌核病病果；所用其它真菌核盤菌S.sclerotiorum、灰霉菌Botrytis cinerea、鏈鉻孢菌Alternaria alternata、擬莖點霉Phomopsissp.、鐮刀菌Fusariumsp.、節(jié)菱孢霉Arthriniumsp.分離自發(fā)病桑椹；桑實杯盤菌(CCTCC AF 2014019)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 內(nèi)生菌的分離純化 將采集的健康桑果小核果用75%酒精表面消毒30 s，然后用4%次氯酸鈉溶液處理2 min，無菌水漂洗3 次，隨即取出，置于PDA 平板上，25 ℃培養(yǎng)[17]；待組織邊緣長出菌落后，將長出的細菌用平板劃線法進行純化，獲得內(nèi)生菌Wh-1 菌株。

1.3 內(nèi)生菌Wh-1 的抑菌譜測定 采用對峙培養(yǎng)法測定分離獲得的內(nèi)生細菌Wh-1 菌株抑菌譜，以未接細菌的菌落為對照，每個處理設(shè)置3 個重復，置25 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)5 d 后，測量其抑菌率；其中，桑椹核地杖菌、肉阜狀杯盤菌在培養(yǎng)20 d 時測算抑菌率；桑實杯盤菌培養(yǎng)2 d 時測算抑菌率。

抑菌率(%) = (對照菌落直徑- 處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

1.4 內(nèi)生拮抗菌Wh-1 的鑒定

1.4.1 形態(tài)學觀察 首先將Wh-1 劃線接種于PDA 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察菌落形態(tài)特征。挑取培養(yǎng)基上的菌落進行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡(DM500，Leica，德國)下觀察其菌體形態(tài)特征。

1.4.2 鑒定儀鑒定 對Wh-1 菌株進行形態(tài)鑒定后，利用Biolog 進行證實。Biolog 系統(tǒng)鑒定結(jié)果主要有 3 個參數(shù)， 即可能性(Probability，PROB)、相似性(Similarity，SIM) 和位距 (Distance，DIST)，以SIM 值最為重要，SIM 值表示測試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應數(shù)據(jù)的相似程度。Biolog 系統(tǒng)規(guī)定:細菌培養(yǎng)當SIM ＞0.50，為系統(tǒng)確定的種屬鑒定結(jié)果，且該值越接近1.00，鑒定結(jié)果的可信度越高。當 SIM ＜0.75(4～6 h)或 0.5(16～24 h)，自動給出的鑒定結(jié)果為屬名[18]。具體方法是:將純化的菌株劃線轉(zhuǎn)接到BUG 培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽蘸輕輕擦下培養(yǎng)基上的菌落，轉(zhuǎn)入專用接種液中(Biolog公司)，制備成均一的菌懸液，再用8 孔移液器將菌懸液分加在 Biolog 鑒定板的各孔中， 每孔各150 μL。蓋上鑒定板蓋，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng) 16～24 h 后，取出鑒定板，置于 Biolog 自動微生物鑒定系統(tǒng)(MicroStationTM，Biolog，美國)上讀取結(jié)果。

1.4.3 分子生物學鑒定 采用 CTAB 法提取Wh-1菌株的基因組DNA，利用超微量分光光度計(NanoDrop One，Thermo Scientific，美國)檢測其濃度及質(zhì)量。采用引物 27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和 1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行 16S rDNA 片段 PCR 擴增。委托擎科生物科技有限公司進行PCR 產(chǎn)物純化和測序。將測序結(jié)果與GenBank 中已知的16S rDNA序列進行 BLAST 比對分析。用 MEGA 5.05 軟件中的最大似然法，選用Tamura-Nei model 模型構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進化樹用自展分析法進行檢驗，循環(huán)1 000 次。

1.5 菌株Wh-1 發(fā)酵濾液理化特性分析

1.5.1 發(fā)酵濾液的制備 先將菌株Wh-1 在PDA平板上于25 ℃活化2 d，再將單菌落接種到含有50 mL PDB 的三角瓶中，于 180 r/min 下，33 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，得到濃度為OD600值等于1.95 的Wh-1發(fā)酵菌液；將所述的發(fā)酵菌液，6 000 r/min 下離心20 min，取離心后的上清液，用孔徑為0.22 μm 的細菌過濾器過濾，得到無菌發(fā)酵濾液。后續(xù)試驗均在發(fā)酵濾液中加入一定量的吐溫，使吐溫終濃度為0.025%。

1.5.2 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵濾液生物活性的影響將Wh-1 單菌落接種到50 mL 液體PDB 培養(yǎng)基置于25 ℃搖床，180 r/min 下，分別振蕩培養(yǎng)24，48，60，72，84 h 后，將不同處理的發(fā)酵濾液按體積分數(shù)1%(V/V)加入PDA 中，用打孔器(直徑6 mm)打取桑實杯盤菌菌絲塊分別接于PDA 平板中央，每個處理設(shè)置3 個重復，置培養(yǎng)箱25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，進行抑菌率測定。

1.5.3 不同體積分數(shù)發(fā)酵濾液生物活性測定 按體積分數(shù)分別為0.1%，0.2%，0.6%，1%，2%，5%(V/V)將不同含量的發(fā)酵濾液分別加入到總體積為10 mL的PDA 平板中，用打孔器打取桑實杯盤菌菌絲塊分別接于發(fā)酵濾液的PDA 上培養(yǎng)，以不加發(fā)酵濾液作為對照，每個處理設(shè)置3 個重復，置培養(yǎng)箱25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 后，分別測定抑菌率。

1.5.4 不同溫度對發(fā)酵濾液生物活性的影響 將制備好的發(fā)酵濾液分別經(jīng) 4， 20，40，60，80，100 ，120 ℃處理20 min 后，將不同處理的發(fā)酵濾液按體積分數(shù)1%(V/V)加入PDA 中，用打孔器打取桑實杯盤菌菌絲塊分別接于PDA 平板中央，每個處理設(shè)置3 個重復，置培養(yǎng)箱25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 后，進行抑菌率測定。

1.6 菌株Wh-1 拮抗機理初步分析

1.6.1 發(fā)酵濾液對桑實杯盤菌抑菌作用的顯微觀察 用打孔器打取桑實杯盤菌菌絲塊接種于發(fā)酵濾液體積分數(shù)為1%(V/V)的PDA 平板中央，25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h 后挑取桑實杯盤菌菌絲體置于顯微鏡下觀察，以不加發(fā)酵濾液PDA 平板上的菌絲體作為對照。

1.6.2 脂肽類化合物合成相關(guān)功能基因分析 用已報道的srfAA、bmyB、bacA、bioA和fenD基因的特異引物[19-21]對菌株Wh-1 的脂肽類化合物合成相關(guān)功能基因進行擴增(表1)。PCR 反應在25 μL 體系中進行:2 × Es Taq Mastermix 12.5 μL，10 μM 引物各 1 μL，模板 DNA 50 ng 1 μL，加入 ddH2O 至體系體積達25 μL。其中srfAA、bmyB、bacA基因 PCR反應條件:95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min、58 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 1 min，共 35 個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸 10 min。bioA和fenD基因 PCR 反應條件:95 ℃預變性 4 min；94 ℃變性 1 min、58 ℃退火1 min、70 ℃延伸 1 min，共 40 個循環(huán)；最后 70 ℃延伸10 min。反應完成后取 5 μL 擴增產(chǎn)物，2 μL 6 × Loading Buffer 溶液和 2 μL Goldenview 核酸染料混合后用于瓊脂糖凝膠電泳(2.5% 瓊脂糖凝膠)，120 V 電壓，電泳40 min 后，在 Bio-Rad 凝膠成像下檢查擴增結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)處理和分析 內(nèi)生拮抗菌抑菌率測定的數(shù)據(jù)，采用DPS(version 3.01)軟件對其進行方差分析，并用LSD 法比較不同處理間的差異顯著性。

表1 供試脂肽類化合物合成相關(guān)功能基因PCR 擴增引物Tab.1 Primers used for PCR analysis of lipopeptide compounds related functional genes

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌Wh-1 的抑菌譜測定 菌株Wh-1對桑實杯盤菌、桑椹核地杖菌和肉阜狀杯盤菌的菌絲生長有顯著抑制作用，抑菌率依次分別為63.15%，100%，100%；對從發(fā)病桑椹上分離的真菌灰霉、鏈格孢、擬莖點霉、鐮刀菌、節(jié)菱孢霉均具有強烈拮抗作用，抑菌率依次分別為88.97%，67.54%，44.23%，37.62%，47.92%(圖1)。

圖1 菌株Wh-1 對發(fā)病桑椹上分離的真菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effect of strain Wh-1 on fungi isolated from diseased mulberry fruits

2.2 內(nèi)生拮抗菌Wh-1 的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 內(nèi)生菌Wh-1 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h 后，菌落呈圓形，表面及邊緣粗糙，呈乳白色，蠟狀(圖2A)。革蘭染色顯示該菌體為革蘭氏陽性桿狀菌株，且能產(chǎn)芽孢(圖2B，C)。

2.2.2 Biolog 鑒定 當Wh-1 菌株 25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)16～24 h，Biolog 自動微生物鑒定系統(tǒng)給出的最大可能結(jié)果是Bacillus megaterium(巨大芽孢桿菌)，其 SIM 值為 0.175；SIM ＜0.50，只能初定為芽孢桿菌屬的細菌。

2.2.3 16S rDNA 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 內(nèi)生菌Wh-1 菌株16S rDNA 基因PCR 擴增測序后得到長度為1 425 bp 的片段，提交該序列相關(guān)信息至GenBank，獲得登錄號MF375212，與 GenBank 中序列在線比對，與多株貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis16S rDNA 序列的同源性高達99%以上。基于16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，Wh-1 菌株與登錄號為 CP022341，MH259879，KX129838 等B.velezensis的親緣關(guān)系最近，處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分枝(圖3)。

圖3 桑椹內(nèi)生拮抗細菌Wh-1 菌株基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of mulberry endophytic antagonistic bacterial strain Wh-1 based on 16S rDNA sequence

2.3 發(fā)酵濾液理化特性

2.3.1 不同培養(yǎng)時間發(fā)酵濾液的生物活性 菌株Wh-1 在發(fā)酵濾液中培養(yǎng)48～72 h 時，其發(fā)酵濾液中拮抗物質(zhì)活性最強，對桑實杯盤菌的抑菌率為90%以上(表2)。

表2 不同處理Wh-1 發(fā)酵濾液對桑實杯盤菌的抑菌作用Tab.2 The inhibition effect of different treaments of Wh-1 fermentation filtrates on C.shiraiana

2.3.2 不同體積分數(shù)發(fā)酵濾液的生物活性 隨著發(fā)酵濾液體積分數(shù)不斷升高，發(fā)酵濾液對桑實杯盤菌的抑制作用不斷增強。當發(fā)酵濾液的體積分數(shù)達到5%時，在PDA 上可以完全抑制桑實杯盤菌的生長(表2)。

2.3.3 不同溫度對發(fā)酵濾液生物活性的影響 發(fā)酵濾液經(jīng)20 ℃處理后抑菌效果最好，4 ℃低溫處理與40～100 ℃高溫處理后，抑菌效果無顯著性差異(表2)，表明發(fā)酵濾液活性成分熱穩(wěn)定性好。

2.4 菌株Wh-1 拮抗機理初步分析

2.4.1 Wh-1 發(fā)酵濾液對桑實杯盤菌的抑制作用桑實杯盤菌在混有Wh-1 發(fā)酵濾液的PDA 培養(yǎng)基上菌落生長衰弱、緩慢。在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲分支近直角，分支處稍有縊縮；而在含有1%發(fā)酵液的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲體膨大成鳥巢狀。說明該菌對桑實杯盤菌菌絲有致畸作用，可以有效抑制菌絲擴展(圖4)。

圖4 菌株Wh-1 發(fā)酵濾液對桑實杯盤菌菌絲的破壞作用Fig.4 The destruction effect of fermentation filtrate of strain Wh-1 on hyphae of C.shiraiana

2.4.2 脂肽類化合物合成相關(guān)功能基因分析 利用已報道的5 對特異引物可從Wh-1 菌株中擴增到srfAA、bmyB、bacA、bioA、fenD基因，如圖5。

圖5 菌株Wh-1 脂肽類化合物合成相關(guān)功能基因擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplification of strain Wh-1 lipopeptide compounds related functional genes

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌Bacillusspp.是廣泛存在于自然界中重要的微生物資源，以生長速度快、 營養(yǎng)需求簡單、抗逆性強以及可以產(chǎn)生多種拮抗物質(zhì)等優(yōu)點成為近年來生防微生物研究的熱點。Sultana 和 Kim 發(fā)現(xiàn)B.thuringiensis優(yōu)于Enterobactersp.抑制桑實杯盤菌菌核萌發(fā)，阻止子囊盤形成，田間試驗表明B.thuringiensis可以降低發(fā)病率[12]。謝潔 等研究發(fā)現(xiàn)B.subtilis7PJ-16 菌株96 h 發(fā)酵濾液對10 種植物病原真菌具有不同程度的抑制作用，其中對桑椹核地杖菌的抑菌率高達100%，且發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性強[22]。發(fā)酵濾液有利于種子萌發(fā)和種苗生長，且對組培苗有促生作用。三年田間試驗結(jié)果表明生防菌懸浮液和發(fā)酵濾液均具有田間防效: 2015年在桑樹花期噴施5 次7PJ-16 菌株的發(fā)酵上清液，其病果率僅為1.83%，較清水對照處理組降低18.66%；2016年生防菌發(fā)酵濾液的防效達到了72.13%，比多菌靈防效低26.03%；2017年噴灑3次109CFU/mL 生防菌懸浮液及其發(fā)酵濾液防效分別為90.84% 和87.78%[22-23]。方翔 等從健康桑樹中分離篩選發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus對桑椹核地杖菌和核盤菌的抑菌效果最為顯著，抑菌率高達98.23%和99.72%，對灰霉菌、腐霉菌等10 種常見植物病原菌具不同程度的抑制作用，且其發(fā)酵濾液熱穩(wěn)定性強[24]。本文作者從健康的桑椹中分離獲得一株內(nèi)生菌Wh-1 對桑椹菌核病3 種主要病原菌均有顯著拮抗作用。根據(jù)菌株的形態(tài)、Biolog 鑒定及分子生物學特征，將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis。在Wh-1 發(fā)酵濾液體積分數(shù)為5%的PDA 平板上桑實杯盤菌不能生長，且Wh-1 發(fā)酵濾液熱穩(wěn)定性好。抑菌機理初步分析發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵濾液對桑實杯盤菌菌絲有致畸作用，可以有效抑制菌絲擴展；同時該菌株對從發(fā)病桑椹上分離的其它真菌如灰霉、鏈格孢、擬莖點霉、鐮刀菌及節(jié)菱孢霉等也有強烈拮抗作用。表明Wh-1 菌株所產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)抗菌譜廣，具有開發(fā)成生防菌劑的潛力，可用于桑椹病害的生物防治，其應用價值值得進一步探索。

芽孢桿菌對病原微生物生長及代謝的抑制作用主要源于其自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如酶類、細菌素、脂肽類及成分復雜的揮發(fā)性物質(zhì)等[25]。有研究證明，貝萊斯芽孢桿菌能產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，是增加作物產(chǎn)量、維護生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的首選生物藥劑[26]。筆者通過對多種脂肽類化合物合成相關(guān)功能基因的PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)菌株Wh-1 具有桿菌溶素、芽孢菌霉素等多種脂肽類化合物合成相關(guān)功能基因。脂肽類化合物合成相關(guān)功能基因的分析為研究Wh-1 的代謝活性物質(zhì)提供了新線索；其相關(guān)功能基因編碼產(chǎn)物的活性，還需要做進一步深入的研究。此外，菌株Wh-1 發(fā)酵濾液的主要抑菌活性成分，其用于桑椹菌核病生物防治的安全性及田間防病效果，有待進一步研究。