墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)的提取方法

陶冬冰，張 旋，張 琦，張佰清

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

墨紅，學(xué)名Rose chinensis Jacq“Crimsin Glory”H.T.，又名朱墨雙輝，從法國引種栽培，該品種花大色艷、香氣濃郁，花瓣厚而多[1]，由于云南氣溫適合周年生長，花期可達(dá)8個月，加上云南高原的紫外線照射，其天然色素與香精的含量非常高，極具經(jīng)濟價值和觀賞價值，目前在昆明、玉溪、楚雄等地都有成片的栽培，規(guī)模可達(dá)到3 km2。

鞣質(zhì)是存在于植物體內(nèi)的一類結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多元酚類化合物。植物鞣質(zhì)在自然界分布極廣，從含鞣質(zhì)的植物性物料中提取的產(chǎn)品可以用作制革鞣劑、木材膠黏劑、選礦抑制劑、防垢除垢劑、金屬絡(luò)合劑等，從而廣泛應(yīng)用于制革、石油開采、木材加工、采礦、涂料、水處理等行業(yè)[2-5]。隨著對鞣質(zhì)生理活性研究的開展，鞣質(zhì)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域，鞣質(zhì)可作為天然的食品添加劑，可以調(diào)節(jié)食品風(fēng)味，同時起到一種高效、無毒且具有保健性的抗氧化和防腐蝕作用[6]。鞣質(zhì)也具有抗衰老、抗紫外線、增白及保濕作用等，可用于護(hù)膚品、染發(fā)劑、牙膏、祛臭劑等日用化學(xué)品中作為活性成分[7-13]。試驗以法國墨紅玫瑰為原料，利用溶劑浸提、超聲波輔助提取、超臨界CO2萃取技術(shù)提高提取鞣質(zhì)的效率，優(yōu)化玫瑰鞣質(zhì)的提取工藝，并為今后鞣質(zhì)的生理活性研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

試驗材料為新鮮的玫瑰花，品種為法國墨紅玫瑰，采于云南七彩云花生物科技有限公司食用玫瑰花基地。

Conc 50型紫外可見分光光度計（瓦里安）、CR21G型高速離心機（日立）、HA121-50-02型超臨界萃取設(shè)備、KQ5200DE型超聲波清洗（昆山超聲）、Labconco Freezone2.5型真空冷凍干燥設(shè)備等。

1.2 試驗方法

1.2.1 鞣質(zhì)的提取方法

（1） 工藝流程。墨紅玫瑰花→原料預(yù)處理（去除花托、留完整花瓣）→烘干→粉碎→預(yù)處理（過篩、脫脂）→提取（浸提、超聲波輔助提取、超臨界CO2提?。婵粘闉V→收集濾液→測定。

（2）預(yù)處理方法。稱取一定量的粉碎過篩后的墨紅玫瑰花粉末，用石油醚在60℃下回流8 h進(jìn)行脫脂，再用氯仿冷浸24 h處理，以除去色素、脂肪等雜質(zhì)。

（3）溶劑浸提方法。按料液比1∶6加提取溶劑在恒溫水浴鍋中浸提一定時間，并多次提取、過濾，合并濾液，減壓濃縮除去有機溶劑，采用Folin-Denis法測定玫瑰鞣質(zhì)含量，然后真空冷凍干燥得到粗提物[14]。

（4）超聲波輔助提取方法。精密稱取脫脂后樣品，加50%丙酮的水溶液。超聲波提取結(jié)束后，過濾，濾液在60℃以下減壓蒸去丙酮，得水溶液。采用Folin-Denis法測定玫瑰鞣質(zhì)含量，然后真空冷凍干燥得到粗提物。

（5） 超臨界CO2萃取方法。準(zhǔn)確稱取脫脂后的樣品，裝入萃取釜密閉，在夾帶劑罐中裝入適當(dāng)夾帶劑，控制超臨界CO2萃取儀器的萃取溫度、萃取壓力、分離溫度、分離壓力等條件，在超臨界狀態(tài)下進(jìn)行萃取，在一定時間后降壓，從分離柱得到提取液，然后減壓濃縮除去有機溶劑，采用Folin-Denis法測定鞣質(zhì)含量，然后真空冷凍干燥得到粗提物[15]。

1.2.2 鞣質(zhì)的定量方法

鞣質(zhì)類化合物在堿性溶液中，可將磷鎢酸鈉還原并生成藍(lán)色化合物，顏色的深淺與鞣質(zhì)含量正相關(guān)，于波長760 nm處測比色，以鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)測得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得對應(yīng)的鞣質(zhì)含量。

①Folin-Denis顯色劑的配制：鎢酸納50 g，磷鉬酸10 g溶于含375 mL水的燒瓶中，再加入25 mL 85%的磷酸，水浴回流2 h，冷卻后定容至500 mL棕色容量瓶中保存。Na2CO3飽和溶液：35 g無水Na2CO3于70℃溶解在100 mL水中，放置過夜。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度0.102 mg/mL的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL標(biāo)準(zhǔn)液加入裝有25 mL水的50 mL容量瓶中，再各加2.5 mL Folin-Denis顯色劑，10 mL Na2CO3飽和溶液，搖勻定容，于室溫下放置30 min后比色，以平均吸光度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度作線性回歸分析，得到回歸方程。

Folin-Denis法測定鞣質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 Folin-Denis法測定鞣質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 提取溶劑對鞣質(zhì)回收率的測定方法

準(zhǔn)確稱取2份墨紅玫瑰花瓣粉末5.00 g，其中1份中加入鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)樣約50 mg，各自按比例1∶6加入提取溶劑，浸提3次，合并濾液，定容至100 mL，另取鞣花酸約50 mg直接溶解于水并定容至100 mL，然后按上述方法進(jìn)行比色測定，測出鞣花酸的含量，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑提取法提取墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)

采用溶劑提取法提取墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)，分別對提取液的選擇、物料粉碎粒度、提取液的濃度、提取時間、提取溫度、提取液pH值進(jìn)行單因素試驗。提取溶劑選擇試驗結(jié)果表明，丙酮溶液和乙醇溶液的提取效果均要好于水，其中60%丙酮和50%乙醇的提取率差別不大，50%乙醇經(jīng)酸化后有助于鞣質(zhì)的提取，并且丙酮和乙醇對鞣質(zhì)的回收率相差不大，所以從提取效率和環(huán)保角度考慮，最終選用酸化的乙醇溶液進(jìn)行提取。物料粉碎粒度單因素試驗結(jié)果表明，隨著物料粉碎粒度的增大，鞣質(zhì)的提取率上升緩慢，所以選擇40目為物料粉碎粒度。

2.1.1 溶劑提取法正交試驗

通過單因素試驗最終選擇影響鞣質(zhì)浸提率的因素主要有提取溫度（A）、提取時間（B）、提取液濃度（C）、提取液pH值（D），設(shè)計四因素三水平的正交試驗，并對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到溶劑提取法的最優(yōu)提取條件。

溶劑提取法L9（34）正交試驗見表1，溶劑提取法L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由正交試驗結(jié)果分析可知，影響因素依次為提取溫度＞提取液濃度＞提取液pH值＞提取時間，說明提取溫度對玫瑰花鞣質(zhì)的影響很大，由表7分析最優(yōu)提取條件為提取溫度60℃，提取時間40 min，提取液體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，提取液pH值3.0，經(jīng)過驗證試驗驗證，最終確定溶劑法提取玫瑰花鞣質(zhì)的提取條件為提取溫度60℃，提取時間40 min，提取液體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，提取液pH值3.0，料液比1∶6，提取率為15.473 mg/g。

表1 溶劑提取法L9（34）正交試驗

表2 溶劑提取法L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果

驗證試驗見表3。

表3 驗證試驗

2.1.2 提取次數(shù)的確定

在相同的提取條件下：稱取2.5 g樣品，用體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇酸性溶液（pH值3.0） 以1∶6的料液比，在60℃條件下每次提取40 min，共提取5次，測定每次提取液中鞣質(zhì)的含量。

玫瑰花鞣質(zhì)分次提取結(jié)果見圖2。

圖2 玫瑰花鞣質(zhì)分次提取結(jié)果

從以上數(shù)據(jù)可以看出，鞣質(zhì)的第1次提取率最高，約為76%，經(jīng)過3次提取后，98%的鞣質(zhì)可以被提出，因此，最終提取3次即可，總提取率達(dá)到20.344 mg/g。

2.2 超聲波輔助提取法提取墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)

稱取樣品（墨紅玫瑰花粉末2.5 g），加60%丙酮的水溶液100 mL。選擇超聲時間、超聲頻率2個因素進(jìn)行均勻設(shè)計試驗，各因素取5個水平。超聲提取結(jié)束后過濾，濾液60℃以下減壓蒸去丙酮，得水溶液。Folin-Denis比色法測定玫瑰花鞣質(zhì)提取率。

按U5（52）表安排的試驗結(jié)果見表4。

表4 按U5（52）表安排的試驗結(jié)果

將試驗結(jié)果用計算機進(jìn)行多元線性回歸分析，得回歸方程：Y=17.645+0.022X1+0.121X2，相關(guān)系數(shù)R=0.967，具有良好的線性關(guān)系。

方差分析結(jié)果見表5。

表5 方差分析結(jié)果

線性回歸中標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)顯示，超聲提取的影響效應(yīng)依次為超聲頻率和超聲時間，其中超聲時間對玫瑰鞣質(zhì)提取率的影響較小。依據(jù)回歸方程和實際條件，選擇玫瑰鞣質(zhì)的最佳超聲提取條件為提取時間20～30 min，超聲頻率為45 kHz。

按上述優(yōu)化的提取條件進(jìn)行玫瑰花鞣質(zhì)超聲波提取驗證試驗，共進(jìn)行3次試驗，得到優(yōu)化條件下的玫瑰花鞣質(zhì)提取率平均為23.72 mg/g，與回歸方程預(yù)測值23.75 mg/g十分接近，且重復(fù)試驗相對偏差不超過1，說明試驗條件重現(xiàn)性良好。最終確定玫瑰花鞣質(zhì)超聲波提取的提取率可以達(dá)到23.72 mg/g。

2.3 超臨界CO2萃取法提取墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)

采用超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)，夾帶劑的選擇、物料粉碎粒度、萃取溫度、萃取時間、萃取壓力、分離溫度、夾帶劑的流量、夾帶劑的用量等均對提取率有一定的影響，所以初步進(jìn)行單因素試驗，由單因素試驗結(jié)果確定夾帶劑選擇乙醇溶液，物料粉碎粒度40目，分離溫度40℃，夾帶劑流量15 mL/min，乙醇相對玫瑰粉用量在3 mL/g為適宜，并篩選出對提取率影響較顯著的因素為萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)，設(shè)計四因素三水平的正交試驗并對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到溶劑提取法的最優(yōu)提取條件。

超臨界CO2萃取法L9（34）正交試驗因素與水平設(shè)計見表6，超臨界CO2萃取法L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。

表6 超臨界CO2萃取法L9（34）正交試驗因素與水平設(shè)計

表7 超臨界CO2萃取法L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由正交試驗結(jié)果直觀分析可知，萃取壓力對玫瑰花鞣質(zhì)的提取率影響最大，而萃取溫度、萃取時間、夾帶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對玫瑰花鞣質(zhì)的提取率影響稍小，為了確定各因素對提取效果的影響及其顯著性，進(jìn)行方差分析。

方差分析見表8，驗證試驗見表9。

表8 方差分析

表9 驗證試驗

由表8根據(jù)方差分析結(jié)果分析，各因素對提取率的影響大小依次為萃取壓力＞萃取時間＞夾帶劑體積分?jǐn)?shù)＞萃取溫度，最優(yōu)提取條件為萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，萃取時間60 min，夾帶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，經(jīng)過驗證試驗驗證，最終確定超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)的提取條件為玫瑰花粉粒度40目，萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，萃取時間60 min，分離溫度40℃，分離壓力8 MPa，夾帶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，流速15 mL/min，乙醇用量3 mL/g，超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)的提取率為44.838 mg/g。

3 討論

在玫瑰花鞣質(zhì)的提取方法研究中采用了溶劑浸提法、超聲波提取法和超臨界CO2萃取技術(shù)3種提取方法，其中溶劑浸提法是植物中生理活性物質(zhì)提取的常用方法，對試驗條件要求低，經(jīng)過3次浸提玫瑰花鞣質(zhì)的提取率可以達(dá)到20.344 mg/g，提取時間為2 h。超聲波提取法是利用超聲波的振動產(chǎn)生強大的能量，作用于細(xì)胞組織，可加速植物中的有效成分進(jìn)入溶劑，增加有效成分的提取量。超聲波提取玫瑰花鞣質(zhì)的提取率達(dá)到24.639 mg/g，比溶劑浸提法提高了21.1%，在30 min就可完成，比溶劑浸提法的時間縮短4倍。

超臨界CO2萃取法利用超臨界流體的特殊性質(zhì)溶解玫瑰花中的有效成分，超臨界流體對玫瑰花中的油脂等具有良好的溶解性，但對極性較強的生理活性成分溶解性較差，根據(jù)相似相溶的原理，使用夾帶劑改變超臨界流體的極性，使鞣質(zhì)可以更多地被溶解出來。超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)的提取率是44.838 mg/g，比普通溶劑法提高了1倍，比超聲波提取法提高了80%，時間1 h。雖然超臨界CO2萃取用的時間較超聲波法長，但超臨界CO2萃取提取率高，每次原料處理量大，并且CO2氣體循環(huán)利用，既提高鞣質(zhì)的提取率，又不會污染環(huán)境。所以最終選用超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)。

4 結(jié)論

溶劑浸提法提取墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)的提取工藝為萃取溫度60℃，萃取時間40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，pH值3.0，料液比1∶6，提取次數(shù)3次，提取率為20.344 mg/g。

墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)的優(yōu)化超聲波輔助提取工藝條件60%丙酮，提取時間20～30 min，超聲頻率45 kHz，鞣質(zhì)提取率為23.72 mg/g。

超臨界CO2萃取法提取墨紅玫瑰花中鞣質(zhì)的提取工藝為玫瑰花粉粒度40目，萃取壓力30 MPa，萃取溫度60℃，萃取時間60 min，分離溫度40℃，分離壓力8 MPa，夾帶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，流速15 mL/min，乙醇用量3 mL/g，超臨界CO2萃取法提取玫瑰花鞣質(zhì)的提取率為44.838 mg/g。