基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的憂遁草治療乙型肝炎的成分分析及作用機制研究

桑圣剛，張瑞，徐亞晨，桑賢正，肖曼

(1海南醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院 檢驗科，?？?570102；2海南醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院，?？?571199;3海軍軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433；4 海南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，?？?71199)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一.慢性HBV感染可導(dǎo)致肝纖維化，肝硬化和肝癌[1,2].針對乙型肝炎的深入研究和有效控制十分迫切.目前臨床上針對乙型肝炎的抗病毒藥物均存在一定的缺陷.海南地區(qū)民間及臨床上治療乙型肝炎均發(fā)現(xiàn)，南藥憂遁草(Clinacanthusnutans)在抗HBV治療上具有很好的功效，但目前其作用機制仍不明了.

憂遁草，又名沙巴舌草，鱷嘴花等，意為“延續(xù)生命”，是重要的傳統(tǒng)醫(yī)藥[3].憂遁草一般以全株或葉片入藥，味甘、辛、微苦，性涼，入肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀消腫、利濕利尿、活血疏經(jīng)、解酒、抗腫瘤等功效.傳統(tǒng)上用于治療多種癌癥、肝炎、黃疸、風(fēng)濕痹痛、外傷跌打等.憂遁草為良好的慢乙肝引經(jīng)藥，可疏通人體郁結(jié)之肝氣，增強了清熱利濕、滋補肝腎的作用.本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特征預(yù)測潛在靶點，篩選建立憂遁草活性成分和乙型肝炎靶點相互作用的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念和相關(guān)技術(shù)手段，探索憂遁草治療乙型肝炎的關(guān)鍵作用機制，為中草藥抗病毒活性研究、改善常規(guī)抗HBV藥物治療乙肝的缺陷提供新的思路.

1 實驗方法

1.1 憂遁草化學(xué)成分挖掘及分析

綜合利用中草藥成分查詢數(shù)據(jù)庫HIT(http://lifecenter.biosino.org/hit/)、TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、NPASS(http://bidd2.nus.edu.sg/NPASS)、TCM-ID(http://bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx)TCM@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)、TCMID(http://www.mega bio net.org/tcmid/search/)及中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、維普中文期刊全文數(shù)據(jù)庫、Pubmed、科學(xué)引文索引(SCI)等常用文獻檢索數(shù)據(jù)庫檢索憂遁草查詢其所有化合物成分，檢索詞為“憂遁草”、“鱷嘴花”、“沙巴舌草”、“Clinacanthusnutans”、“you dun cao”等，將所有化合物名稱整理成EXCEL表格.使用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)平臺對各化合物分子結(jié)構(gòu)進行確證，保存各化合物SMILES結(jié)構(gòu)式、化合物2D、3D結(jié)果SDF文件備用.利用Linpinski 五規(guī)則查詢化合物ADME信息，分析各化合物的類藥性，具體內(nèi)容包括分子量小于500 ；氫鍵供體數(shù)目小于5；氫鍵受體數(shù)目小于10；脂水分配系數(shù)小于5.符合Lipinski規(guī)則的化合物會有更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)代謝過程中會有更高的生物利用度.如果化合物違背5規(guī)則(違背2項以上)，則該化合物很難成藥.

1.2 憂遁草化學(xué)成分作用靶點預(yù)測

綜合使用STITCH(http://stitch.embl.de/)、Swiss target prediction(http://swisstarget prediction.ch/)在線分析軟件及TargetNet (http://targetnet.scbdd.com)QSAR模型靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫，預(yù)測憂遁草中有效化學(xué)成分的作用靶點，并將結(jié)合分?jǐn)?shù)大于0.5的大分子蛋白作該成分的有效靶點，提取作用靶基因名稱構(gòu)建憂遁草化學(xué)成分靶點交互作用網(wǎng)絡(luò).

1.3 憂遁草“成分- 靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用在線OMIM(https://omim.org/)、DisGeNET(http://www.disgenet.org/)、GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)常用疾病基因數(shù)據(jù)庫獲取乙型肝炎相關(guān)基因.多數(shù)據(jù)庫檢索已報道的乙型肝炎相關(guān)蛋白，提取80%以上疾病基因，作為疾病特異性靶基因.通過對于憂遁草有效成分的靶蛋白及乙型肝炎疾病靶點交叉分析，獲取憂遁草治療乙型肝炎的核心靶點，使用 Cytoscape 軟件(Version3.6.1, http: //www.cytoscape.org)構(gòu)建藥物-成分-靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò).整個網(wǎng)絡(luò)展示成分-靶點之間的聯(lián)系，通過構(gòu)建這一網(wǎng)絡(luò)探析憂遁草治療乙型肝炎的作用機制.

1.4 憂遁草治療乙型肝炎蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)

將憂遁草的類藥活性成分所映射的靶基因和乙型肝炎相關(guān)的疾病基因進行維恩分析，獲得兩者的交叉共同基因即為憂遁草治療乙型肝炎的核心靶點.將憂遁草治療乙型肝炎的靶點導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)及 GeneMANIA(http://genemania.org/)蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站，構(gòu)建憂遁草治療慢性乙型肝炎蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò).

1.5 憂遁草治療乙型肝炎GO分析與KEGG分析

生物信息數(shù)據(jù)庫DAVID整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表(成百上千個基因ID或者蛋白ID列表)提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，并可進行基因本體(GO)分析和KEGG通路分析，借此挖掘特定基因或蛋白的生物學(xué)意義.將關(guān)鍵靶點基因輸入David數(shù)據(jù)庫功能注釋工具中(Version 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)，GO富集分析選擇生物過程(biological process)，分子功能(molecular function)，和細(xì)胞組成(cellular component)3 個模塊，通路分析選擇 KEGG，設(shè)定P<0.05 以確定關(guān)鍵靶點富集通路.使用OMICshare將富集結(jié)果繪制成高級氣泡圖(圖5).

2 結(jié)果

2.1 憂遁草化學(xué)成分挖掘及分析

經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索整理共獲得憂遁草化合物59種，將名稱整理成EXCEL表格使用PubChem平臺對各化合物分子結(jié)構(gòu)進行確證，保存化合物SMILES結(jié)構(gòu)式，在線分析平臺TargetNet查詢化合物L(fēng)inpinski 五規(guī)則，ADME信息，分析各化合物的類藥性，篩選出五規(guī)則符合度高于75%的27種化合物作為進一步分析的類藥化合物.化合物信息見表1.

表1 憂遁草27種類藥性化合物信息

2.2 憂遁草化學(xué)成分作用靶點預(yù)測

使用STITCH、Swiss target prediction在線分析軟件及TargetNet QSAR模型靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫，預(yù)測憂遁草中有效化學(xué)成分的作用靶點，獲得27種類藥成分靶點共1758個，篩選成分-靶點結(jié)合分?jǐn)?shù)>0.5的靶基因，共獲得271個興趣基因，應(yīng)用在線OMIM、DisGeNET、GEO常用疾病基因數(shù)據(jù)庫獲取乙型肝炎相關(guān)基因.多數(shù)據(jù)庫檢索檢索已報道乙型肝炎相關(guān)蛋白，提取80%以上疾病基因，獲得乙型肝炎疾病特異性靶基因282個，將藥物興趣基因與疾病特異性靶點進行維恩分析，獲得關(guān)鍵靶基因20個，分別為TNF、CASP9、APOBEC3G、IKBKB、TGFBR1、PTPRC、CASP3、MAPK10、AR、HNF4A、RELA、RARB、CDK2、AKT1、MET、PIK3CG、PIK3CA、BCL2、PIK3CB、PIK3CD.結(jié)果如圖1所示.

圖1 憂遁草類藥成分靶基因與乙肝疾病基因維恩分析

2.3 憂遁草“成分- 靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的20個關(guān)鍵靶基因映射所屬類藥成分，發(fā)現(xiàn)27種類藥成分中有16種成分參與對關(guān)鍵靶基因的調(diào)控，構(gòu)建成分-靶點關(guān)系對文件，使用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，通過節(jié)點屬性可知連接度前三位的成分分別為isovitexin、beta-Sitosterol、phytol，這可能為憂遁草治療乙型肝炎的關(guān)鍵化合物.結(jié)果見圖2.

2.4 憂遁草治療慢性乙型肝炎靶點蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)

將憂遁草治療乙型肝炎的靶點導(dǎo)入STRING及 GeneMANIA 蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)站，構(gòu)建憂遁草治療慢性乙型肝炎蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)PPI文件，利用Cytoscape 軟件進行關(guān)鍵節(jié)點分析，通過節(jié)點連接度大小呈現(xiàn)關(guān)鍵靶基因的權(quán)重，使用節(jié)點大小及顏色深淺凸顯靶基因在乙肝疾病治療中的不同作用，共獲得20個節(jié)點，68個相互關(guān)系，其中TNF、AKT1、PIK3CA、CAS3、CAS9處于節(jié)點關(guān)鍵位置，表明它們是治療疾病的核心蛋白.具體結(jié)果見圖3.

綠色為關(guān)鍵靶基因，紅色為有效成分

通過顏色深淺與形狀大小顯示出Hub節(jié)點

2.5 憂遁草治療乙型肝炎GO分析與KEGG分析

使用DAVID 進行基因本體(GO)分析和 KEGG 通路分析.將關(guān)鍵靶點基因輸入David數(shù)據(jù)庫，然后進行GO富集分析KEGG通路分析.使用OMICshare將富集結(jié)果繪制成高級氣泡圖.關(guān)鍵基因GO功能富集如結(jié)果圖4(a)顯示，KEGG 富集出80條通路，去除廣泛通路后，如圖4(b)顯示，排名靠前的主要相關(guān)信號通路如下：乙型肝炎疾病通路、癌癥通路、凋亡信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等.富集結(jié)果顯示憂遁草有效成分呈現(xiàn)出通過多靶點多通路達到治療乙型肝炎的可能性.其中作用于乙型肝炎疾病通路的富集結(jié)果顯示，化合物通過PI3K/AKT、MAPK、NF-kappa B等免疫或炎癥途徑對乙肝疾病的進展產(chǎn)生影響(圖5).

圖4 關(guān)鍵基因GO富集分析(a)與KEGG pathway富集分析(b)

3 討論

當(dāng)前研究普遍認(rèn)為HBV感染慢性化的關(guān)鍵機制是機體對HBV產(chǎn)生了特異性的免疫耐受.目前臨床上抗HBV主要使用干擾素類、核苷類和中成藥等藥物[4，5],但整體呈現(xiàn)出或總體療效不佳，或不良反應(yīng)多，亦或?qū)е履退幮缘葐栴}[6，7].中草藥作為天然藥物呈現(xiàn)出抗病毒療效更佳、副作用更小的鮮明特點[8].

憂遁草可能為很好的抗乙肝藥物.本研究中藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)顯示，憂遁草主要活性成分異牡荊素(isovitexin)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、葉綠醇(phytol)為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點，提示它們在憂遁草對乙肝治療中發(fā)揮著重要作用，這與目前的相關(guān)研究結(jié)果存在很大一致性，證明了虛擬結(jié)果的可靠性較高.

圖5 乙型肝炎疾病信號通路基因顯著富集圖

研究表明憂遁草氯仿提取物在體外對多種癌細(xì)胞顯示出顯著的抗增殖作用[9].另外，憂遁草增強了CD8+T細(xì)胞在炎性或腫瘤細(xì)胞的浸潤，激活了CD8+T細(xì)胞的功能[10].異牡荊素是很多中草藥的活性成分[11].異牡荊素具有抗炎、抗氧化活性及抗阿爾茨海默病的作用[12]，異牡荊素還具有抗肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌的活性[13].β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、抗腫瘤等功效[14].葉綠醇衍生物可通過誘導(dǎo)一系列趨化因子和細(xì)胞因子的表達而發(fā)揮免疫刺激活性從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[15].這些初步研究提示出憂遁草對于機體免疫功能的調(diào)節(jié)與惡性腫瘤的防治有功效，具有極大的成藥潛力與研究價值.

以上結(jié)果說明憂遁草可通過多成分、多靶點的協(xié)同作用而充分發(fā)揮作用，為中藥多組分多靶點作用的挖掘與研發(fā)提供了新思路，也為目前鮮有報道的活性成分指明未來深入研究的方向.研究得到憂遁草治療乙肝的關(guān)鍵靶點基因20個，進一步的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示TNF、AKT1、PIK3CA、CAS3、CAS9這5個關(guān)鍵靶點在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，提示其可作為憂遁草治療乙肝的核心靶點.

腫瘤壞死因子(TNF)是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子.TNF對病毒清除至關(guān)重要，TNF有多種途徑發(fā)揮抗病毒活性[16-19].PI3K/Akt信號通路是細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)一個重要紐帶, 在細(xì)胞抗凋亡、增殖、分化以及侵襲轉(zhuǎn)移中起到至關(guān)重要作用[20].PIK3CA是屬于PI3K-Akt信號通路中的一個關(guān)鍵原癌基因，蛋白激酶B(AKT1)也是該通路重要分子.caspase家族是一組具有相似氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能的蛋白水解酶，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者.caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)殺傷機制的重要組成部分，提示caspase 9蛋白低表達可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡機制障礙，細(xì)胞增殖失去控制，從而參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程，并與肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)[21].

GO注釋結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點涉及的細(xì)胞成分為影響細(xì)胞質(zhì)的功能，分子功能主要為干預(yù)1-磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、類固醇激素受體活性及影響ATP結(jié)合過程.生物過程包括肽基絲氨酸磷酸化的調(diào)節(jié)、NF-Kappa B轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)、外源性凋亡信號通路的調(diào)控、葡萄糖代謝過程、細(xì)胞增殖、蛋白激酶B(AKT)過程的調(diào)節(jié)、RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄及基因表達調(diào)控等多個層面發(fā)揮作用.這些生物學(xué)過程在藥物活性成分抗炎抗病毒機制的發(fā)揮及靶點所涉及的通路都有所體現(xiàn).

此外，研究中藥物關(guān)鍵靶點主要富集的通路為乙型肝炎疾病通路、癌癥通路、凋亡信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等.這些通路都與炎癥的發(fā)生發(fā)展乃至惡性癌變的過程高度相關(guān)，通路富集的結(jié)果表明憂遁草的活性成分作用的核心靶點映射于不同的通路，可通過各通路協(xié)調(diào)共同發(fā)揮藥效，這與目前對靶點基因的相關(guān)研究結(jié)果及藥物活性成分所能作用的通路基本一致，也為更進一步的機制研究指明方向.

對憂遁草的多成分、多靶點與乙肝疾病間的多元網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的研究結(jié)果初步表明了憂遁草主要潛在活性成分及作用靶點、作用病種及相關(guān)通路，為進一步深入探討其作用機制提供了新思路，但仍需進一步的基礎(chǔ)研究與臨床實驗為虛擬預(yù)測結(jié)果作支撐.