循環(huán)腫瘤DNA在乳腺癌治療中的應(yīng)用進(jìn)展

郝帥 田武國 高博 何渝軍 羅東林

[摘要] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，并且是癌癥致死的主要原因。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中會持續(xù)釋放腫瘤細(xì)胞DNA入血，這些循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）攜帶腫瘤相關(guān)的基因突變信息，使其成為潛在的癌癥生物標(biāo)志物。ctDNA檢測作為液體活檢的一種，簡單易行，能夠以微創(chuàng)的方法動態(tài)監(jiān)測腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)，在乳腺癌領(lǐng)域得到廣泛研究，在疾病療效監(jiān)測、耐藥識別、預(yù)測復(fù)發(fā)、判斷預(yù)后等方面具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌;循環(huán)腫瘤DNA;液體活檢

[中圖分類號] R473.73? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（c）-0043-04

Application Progress of circulating tumor DNA in the treatment of breast cancer

HAO Shuai? ?TIAN Wuguo? ?GAO Bo? ?HE Yujun? ?LUO Donglin

Department of Breast， Thyroid Surgery， Research Institute of Surgery， Daping Hospital， Army Military Medical University， Chongqing? ?400042， China

[Abstract] Breast cancer is one of the most common malignant tumors in women and the leading cause of death from cancer. Tumor cell DNA is continuously released into the blood during the development of tumor. These circulating tumor DNA （ctDNA） carry the information of tumor-related gene mutation， making it a potential cancer biomarker. As a kind of liquid biopsy， ctDNA detection is simple and easy， and can dynamically monitor tumor progression and treatment response with minimally invasive methods. It has been widely studied in the field of breast cancer， and has potential clinical application value in the aspects of disease efficacy monitoring， drug resistance identification， recurrence prediction and prognosis judgment.

[Key words] Breast cancer; Circulating tumor DNA; Liquid biopsy

早在1948年，Mandel等[1]發(fā)現(xiàn)血漿中存在游離的核酸分子，即細(xì)胞游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）。1977年，Leon等[2]發(fā)現(xiàn)癌癥患者血漿中cfDNA的水平明顯高于健康人群，Shapiro等[3]同樣發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者具有比良性疾病患者更高水平的cfDNA，這表明cfDNA可能與腫瘤相關(guān)。原發(fā)腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、其他組織中的微轉(zhuǎn)移灶通過凋亡、壞死或直接分泌的方式釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在人體血液中不斷流動的攜帶一定特征（包括突變、缺少、插入、重排、拷貝數(shù)異常、甲基化等）的腫瘤基因組DNA片段稱為循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）[4]。

ctDNA包含與原發(fā)實體腫瘤一致的基因變異特征，這一特點有助于鑒別腫瘤或正常細(xì)胞來源的DNA，因此ctDNA具有作為潛在的腫瘤標(biāo)志物的價值[5]。與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)類生物標(biāo)志物比較，ctDNA具有更短的半衰期，這一特點使ctDNA能夠反映腫瘤的最新動態(tài)信息，便于對腫瘤患者的病情進(jìn)行實時監(jiān)測[6]。

1 ctDNA檢測技術(shù)

外周血中DNA含量極低[7]，因此高靈敏度的ctDNA檢測方法至關(guān)重要。ctDNA檢測主要包括以PCR和以二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)為基礎(chǔ)的方法，均有助于辨別cfDNA中少量攜帶腫瘤相關(guān)變異的片段，實現(xiàn)ctDNA的定量和定性檢測[8]。

以PCR為基礎(chǔ)的ctDNA檢測技術(shù)適用于單個或數(shù)個基因位點的檢測。1994年，歷史上首次應(yīng)用等位基因特異性PCR方法在胰腺癌患者血液中識別了KRAS突變[9]，該技術(shù)受限于較低的靈敏度，目前正被其他方法所取代。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR），微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[10]以及BEAMing[11]等檢測技術(shù)均成功應(yīng)用于ctDNA的檢測分析，上述方法可以檢測到低至0.001%～0.010%的突變，盡管基于ddPCR的檢測方法具有較高的靈敏度，但其檢測范圍僅局限于少量基因位點，嚴(yán)重限制了ctDNA研究的廣度。

NGS技術(shù)能夠避免這一局限性，其具有同時檢測大規(guī)模體細(xì)胞DNA突變的能力，能夠識別未知的突變[12]，在揭示基因組的復(fù)雜性和腫瘤異質(zhì)性中具有獨特優(yōu)勢。Chicard等[13]聯(lián)合應(yīng)用全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）與深度覆蓋靶向測序研究腫瘤的克隆異質(zhì)性，并比較了實體腫瘤和cfDNA之間的體細(xì)胞突變和拷貝數(shù)改變。此外，Manier等[14]應(yīng)用WES來對比CTCs、cfDNA和原發(fā)腫瘤的突變信息和拷貝數(shù)變異，獲得了高度的一致性。近來，Newman等[15]設(shè)計了深度測序癌癥個性化圖譜（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）技術(shù)，其檢測突變等位基因片段的敏感度低至0.02%，并且具有96%的特異性，該技術(shù)的相關(guān)研究已廣泛開展[16]。無論是基于PCR或者NGS技術(shù)的檢測方法，更廣的檢測范圍和更高的靈敏度均有助于ctDNA檢測在惡性腫瘤中的臨床應(yīng)用。

2 ctDNA在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，與傳統(tǒng)組織活檢比較，ctDNA檢測能夠提供更全面的腫瘤遺傳學(xué)信息，并且具有簡便易行、無創(chuàng)、可實時動態(tài)檢測等優(yōu)點，在乳腺癌領(lǐng)域得到廣泛研究，在腫瘤負(fù)荷監(jiān)測、療效評估、預(yù)后分析等方面具有一定的臨床價值[17]。

2.1 ctDNA與乳腺癌腫瘤負(fù)荷的監(jiān)測及療效評估

腫瘤負(fù)荷是指腫瘤對人體的危害程度，包括腫瘤的大小、活躍程度、轉(zhuǎn)移情況。其監(jiān)測主要依賴于影像學(xué)檢查和蛋白質(zhì)類生物學(xué)標(biāo)志物的檢測，然而上述方法均存在一定的局限性。ctDNA檢測作為液體活檢技術(shù)的一種，具有較好的靈敏度和特異度，并且ctDNA水平與腫瘤負(fù)荷直接相關(guān)。因此，通過ctDNA檢測可以實現(xiàn)腫瘤負(fù)荷變化的監(jiān)測，進(jìn)而實時反映治療的效果，指導(dǎo)治療決策的制訂[18]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)隨著惡性腫瘤的進(jìn)展，ctDNA的水平逐漸升高，而隨著手術(shù)或化療等治療的開展，ctDNA會隨之下降[19]。并且ctDNA具有更短的半衰期，能夠更加迅速的評估腫瘤的動態(tài)變化。早在2008年，Diehl等[20]就發(fā)現(xiàn)，APC、KRAS、TP53、PIK3CA等基因突變的頻率會隨著治療過程而變化，變化趨勢與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)。Dawson等[21]研究得出了相似的結(jié)論，治療過程中ctDNA拷貝數(shù)變化曲線體現(xiàn)出與腫瘤負(fù)荷變化和治療效果的一致性，提示ctDNA可用于監(jiān)測腫瘤負(fù)荷的變化。Riva等[22]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌新輔助治療期間ctDNA水平迅速下降，而ctDNA水平下降緩慢的患者存活率相對較低，進(jìn)一步表明ctDNA可以反映乳腺癌的治療反應(yīng)。

基因甲基化狀態(tài)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用。Takahashi等[23]對87例乳腺癌化療前、后血漿標(biāo)本進(jìn)行甲基化RASSF1基因檢測，治療有效患者的甲基化水平顯著下降（P = 0.006）。Fiegl等[24]研究發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論，表明ctDNA的RASSF1A甲基化檢測能夠監(jiān)測治療的療效。Fackler等[25]開發(fā)了定量多元甲基化特異PCR技術(shù)，檢測乳腺癌中較易發(fā)生甲基化的10個基因，發(fā)現(xiàn)病情穩(wěn)定或者治療有效患者的DNA甲基化程度顯著降低，而疾病進(jìn)展或無效的患者則相反。

因此，無論分期早晚，ctDNA的動態(tài)監(jiān)測能夠?qū)崟r反映腫瘤負(fù)荷情況，進(jìn)而反映治療效果，對于協(xié)助臨床診斷、指導(dǎo)臨床決策具有重要意義。

2.2 ctDNA與乳腺癌基因型動態(tài)檢測及耐藥的識別

隨著治療的開展，癌細(xì)胞會發(fā)生克隆進(jìn)化，失去和/或獲得新的改變而發(fā)生演變，從而導(dǎo)致對以前有效的治療產(chǎn)生抗藥性[26]。因此在疾病治療的全程動態(tài)檢測腫瘤克隆基因組具有重要價值[27]。

ER陽性的晚期乳腺癌患者通過ctDNA檢測能夠發(fā)現(xiàn)ESR1突變，這是導(dǎo)致患者對芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor，AI）耐藥的原因[28]。Schiavon等[29]研究證實了這一點，ESR1突變?nèi)橄侔┗颊呓邮蹵I治療后PFS明顯短于血漿未檢測到ESR1突變患者。多數(shù)接受抗HER-2靶向治療的乳腺癌患者，會產(chǎn)生對曲妥珠單抗隆抗體的耐藥，當(dāng)前臨床上尚無準(zhǔn)確預(yù)測上述耐藥的檢測手段。Miller等[30]研究發(fā)現(xiàn)PIK3CA突變的存在可能是HER-2靶向藥物較好反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)。此外，Maass等[31]發(fā)現(xiàn)存在PI3K基因突變的乳腺癌患者抗HER-2治療效果較差，其完全緩解率僅為19%，而沒有該基因突變的患者可以達(dá)到33%。Wang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，通過ctDNA進(jìn)行HER-2狀態(tài)的檢測與原發(fā)腫瘤HER-2狀態(tài)具有很高的一致性，表明治療過程中通過ctDNA檢測HER-2拷貝數(shù)的變化能夠篩查對曲妥珠單抗敏感的人群并監(jiān)測療效。2013年Nature雜志的一項研究揭示了ctDNA突變在探索乳腺癌繼發(fā)性耐藥機制中的價值，Murtaza等[33]在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，紫杉醇治療后ctDNA檢出PIK3CA突變的頻率升高并預(yù)示出現(xiàn)紫杉醇耐藥。在另一項研究中，Murtaza等[34]對1例ER陽性、HER-2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進(jìn)行全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)PIK3CA（E542K）突變頻率的升高與他莫昔芬聯(lián)合曲妥珠單抗耐藥相關(guān)，拉帕替尼耐藥后患者血漿ERBB4（H809G）突變頻率明顯增高。

治療過程中癌細(xì)胞會發(fā)生克隆進(jìn)化，如果能及時識別基因改變狀態(tài)，調(diào)整治療方案，就能避免無效的治療，使患者最大獲益。

2.3 ctDNA與微小殘留病灶的識別及預(yù)后的預(yù)測

復(fù)發(fā)是癌癥治療面臨的主要難題之一，往往與治療后腫瘤成分的殘留，即微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）有關(guān)。利用術(shù)后ctDNA特征突變是否檢出、突變頻率值或術(shù)前術(shù)后突變頻率的變化，均可以作為MRD和預(yù)后的判斷指標(biāo)。

Garcia-Murillas等[35]通過動態(tài)檢測乳腺癌治療期間的ctDNA，發(fā)現(xiàn)在50%的復(fù)發(fā)患者中術(shù)后首次ctDNA檢測即為陽性，并能平均早于臨床影像學(xué)檢查7.9個月預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Reinert等[36]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在部分復(fù)發(fā)病例中，ctDNA突變頻率增加并早于影像學(xué)和蛋白質(zhì)標(biāo)志物的變化，便于臨床醫(yī)生及時采取相應(yīng)的治療措施。

當(dāng)前ctDNA預(yù)測預(yù)后潛能的研究多基于一個或數(shù)個突變位點，而特異性基因重排同樣可用于MRD的識別，并且具有更大的潛力[37]。Harris等[38]基于NGS技術(shù)，通過癌癥患者染色體重排的個性化特征，應(yīng)用于預(yù)測轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的發(fā)生。Olsson等[39]開展的研究旨在評價ctDNA監(jiān)測乳腺癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價值，與臨床檢查比較，在86%的患者中，ctDNA提前了平均11個月預(yù)測疾病的復(fù)發(fā)，術(shù)后ctDNA的檢出預(yù)示著明顯縮短的DFS，并且ctDNA的水平與患者OS相關(guān)。

MRD的檢出情況有助于早期識別癌癥患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險，以此來給患者分類，依據(jù)高危、低危復(fù)發(fā)風(fēng)險安排最優(yōu)的治療，使患者最大獲益。

3 結(jié)語

ctDNA檢測由于實時、無創(chuàng)、靈活等特點，可以應(yīng)用于乳腺癌診治的各個階段。當(dāng)前以PCR或NGS為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，提高了ctDNA檢測的敏感性，提供了更加全面精確的腫瘤遺傳基因組學(xué)信息。然而，亟須更多的大規(guī)模、前瞻性研究來評估ctDNA在乳腺癌臨床診治中的價值，以期改善患者生存。

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