蛹蟲草培養(yǎng)基中多肽的提取分離工藝

雷燕妮， 張小斌*， 李多偉， 楊 梅

(1.商洛學(xué)院， 陜西 商洛 726000； 2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710069； 3.陜西富士金醫(yī)藥保健品有限責(zé)任公司， 陜西 西安 710075)

蛹蟲草〔Cordycepsmilitaris(Fr.) Link.〕別名北蟲草，屬子囊菌亞門麥角菌科蟲草屬[1]，與冬蟲夏草同屬，是一種具有滋補(bǔ)作用的中藥和營養(yǎng)品，含有大量的蛋白質(zhì)、糖類、脂類、維生素和多種微量元素，及蟲草素、蟲草酸與超氧化物歧化酶(SOD)等各類生物活性物質(zhì)，因此，具備提升免疫力、抗腫瘤和抗炎等功效[2-5]。楊爽等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草小分子肽具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力及抗氧化損傷等特點。蛹蟲草因其突出的功效與作用已被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新食品原料(2009年第3號)，其植物多肽良好的功效作用已日益受到廣大消費(fèi)者青睞，國內(nèi)人工栽培面積不斷擴(kuò)大，已有大量藥品、保健品及食品等深加工產(chǎn)品上市。目前，有關(guān)蟲草素與蟲草多糖的研究屢見不鮮，但鮮見對蟲草蛋白與蟲草多肽的研究報道。鑒于此，以蛹蟲草培養(yǎng)基中多肽的含量為指標(biāo)，采用雙因素試驗、單因素試驗和正交試驗相結(jié)合的方法[8]，對蛹蟲草培養(yǎng)基多肽提取工藝進(jìn)行探索，旨在為蛹蟲草資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1蛹蟲草培養(yǎng)基由徐州鴻宇農(nóng)業(yè)科技集團(tuán)提供，西北大學(xué)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)部鑒定。

1.1.2試劑99%牛血清白蛋白(BSA)，美國Sigma公司；乙醇、磷酸等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，市購；蒸餾水，自制。

1.1.3儀器設(shè)備 ME235S電子分析天平，德國Sartorius公司；201紫外可見分光光度計，美國FISHER公司；H-H-S21-6C電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠；RE-2000 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-C循環(huán)水式多用真空泵，開封市宏興科教儀器廠；101A-2鼓風(fēng)干燥箱，上海市實驗儀器總廠；SB-4200DT超聲清洗器，寧波新芝儀器設(shè)備有限公司；LD5-10高速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠； KRT-TU-1812-3多功能膜設(shè)備，合肥科銳特環(huán)保工程有限公司；YC-1800實驗室中藥噴霧干燥機(jī)，上海雅程儀器設(shè)備有限公司；FZ102植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1材料預(yù)處理

1) 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液制備。精確稱量考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg，用50 mL 90%乙醇充分溶解，再加入100 mL 85%磷酸(W/V)，最后用蒸餾水定容至1 000 mL，均勻混合后置于棕色瓶內(nèi)儲存。該溶液室溫保存有效期為30 d，使用前需用中性濾紙濾取溶液后再用。

2) 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備。稱取牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg，加水溶解并定容至100 mL (250 μg/mL)，從中吸取40 mL用蒸餾水稀釋并定容至100 mL(100 μg/mL)得標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3) 繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照文獻(xiàn)[9-12]的方法采用紫外可見分光光度計法進(jìn)行測定。取6支10 mL干凈具塞試管，依次編號1～6，并設(shè)置1號試管為空白對照加入1 mL蒸餾水，其余5支試管依次添加0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，之后依次添加蒸餾水至1.0 mL。在檢測過程中，所有試管添加5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，并混合均勻，放置2 min，于595 nm波長條件下開始檢測，以蛋白含量(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，擬合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2蛹蟲草培養(yǎng)基多肽提取溶劑及提取方法的篩選采用雙因素試驗設(shè)計，即A提取溶劑(蒸餾水)，A1～A4pH依次分別為 6.5、7.5、8.5和9.5；B提取方法，B1～B2分別為熱回流提取2.0 h，超聲(20 kHz)提取1.0 h。精確稱取蛹蟲草培養(yǎng)基粉末8份各50.00 g，按1∶20料液比分別加入試驗設(shè)計蒸餾水，浸泡1.0 h后在85℃水浴中分別熱回流提取或超聲提取，過濾取濾液，用稀酸或稀堿溶液調(diào)整濾液pH至7.5左右，加入中性蛋白酶5‰(V/V)，控制45℃酶解溫度下攪拌酶解4 h，用2 000 Da超濾膜過濾，濾除多糖、未水解徹底的大分子成分等，濾液再經(jīng)反滲透膜濃縮，濃縮液用40%乙醇定容至500 mL。用紫外可見分光光度計測定多肽溶液的吸光度，并計算含量。

1.2.3蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的提取采用單因素試驗設(shè)計，即P提取溶劑蒸餾水pH，P1～P4依次分別為pH 6.5、pH 7.5、pH 8.5及pH 9.5；T提取時間，T1～T4分別為30 min、45 min、60 min和75 min；L料液比，L1～L4分別為1∶10、1∶15、1∶20和1∶25；C提取次數(shù)，C1～C4分別為1次、2次、3次和4次。按試驗設(shè)計精確稱取蛹蟲草培養(yǎng)基粉末50.00 g各4份，分別置于2 000 mL燒瓶中，采用1.2.2中獲得的最佳提取方式提取與過濾，濾液用稀酸或稀堿溶液調(diào)pH至7.5左右，加入中性蛋白酶5‰(V/V)，控制45℃酶解溫度下攪拌酶解4 h，用2 000 Da超濾膜過濾，濾除多糖、未水解徹底的大分子成分等，濾液再經(jīng)反滲透膜濃縮，濃縮液用40%乙醇定容至500 mL。用紫外可見分光光度計測定多肽的吸光度并計算含量。確定不同提取條件下提取因素的變化范圍，以及各因素的最佳參數(shù)。在此基礎(chǔ)上采用L9(34)進(jìn)行正交試驗，分析提取溶劑、提取時間、料液比及提取次數(shù)對蛹蟲草培養(yǎng)基內(nèi)多肽提取的作用水平，進(jìn)而找到最合適的提取條件。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2003和Spss進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的提取溶劑及提取方法

從圖1看出，蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的超聲法提取效果均優(yōu)于相同條件下的熱回流法，但二者均隨提取溶劑pH升高呈先升后降趨勢。其中，超聲法和熱回流法提取對蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的提取能力均為提取溶劑pH 8.5>pH 7.5>pH 9.5>pH 6.5。二者均以蒸餾水pH 8.5條件下的提取率最高，分別為22.28%和20.75%，超聲法提取率較熱回流法高7.37%。因此，后續(xù)試驗確定采用蒸餾水pH 8.5超聲提取法進(jìn)行蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的提取。

圖 1不同提取方法各溶劑濃度蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的提取率

Fig.1 Extraction rate of polypeptides from cordyceps militaris medium with different solvent concentrations

2.2不同因素處理蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的提取率

不同因素對蛹蟲草培養(yǎng)基多肽提取率的影響存在差異。

2.2.1 提取溶劑pH超聲提取蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的提取率隨pH增加呈先升后降趨勢，弱堿性水溶液有利于多肽的提出。最佳水溶液pH 8.5左右，其提取率為22.28%；其次pH 7.5，提取率為21.85%。

2.2.2 提取時間蛹蟲草培養(yǎng)基多肽超聲提取率隨提取時間延長而增加，其中，45 min后多肽超聲提取率增加緩慢，45～75 min超聲提取率為22.28%～22.30%，時間的延長大大增加能耗和用工，造成生產(chǎn)成本的增加，故超聲提取時間應(yīng)控制在45～60 min為宜。

2.2.3 料液比蛹蟲草培養(yǎng)基多肽超聲提取率隨提取料液比的增加而增高，料液比1∶15時提取率為21.46%，之后多肽超聲提取率的增幅變小，1∶20～1∶25超聲提取率為22.28%～22.31%，超聲提取料液比的增加大大增加溶劑用量，并增加溶耗和后續(xù)濃縮的成本，造成生產(chǎn)成本的增加，故最佳超聲提取料液比確定為1∶15為宜。

2.2.4 提取次數(shù)隨提取次數(shù)的增加，提取2次、3次和4次蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的超聲提取效果均較好，提取2次的提取率為22.28%，增幅較大，較提取1次(17.92%)提高4.36%；但提取次數(shù)超過2次后，提取率的增幅減小，提取3次和4次的提取率分別為22.32%和22.35%。超聲提取次數(shù)增加會延長生產(chǎn)周期及增加溶劑的用量，增加生產(chǎn)成本，因此，超聲提取次數(shù)以2次為宜。

2.3蛹蟲草培養(yǎng)基中多肽提取率的正交試驗

由2.2的結(jié)果確定水超聲提取蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的L9(34)正交試驗方案(表1)。其中，方案6蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的提取率最高，為22.26%；其次是方案5，為22.04%。從表2看出，A因素極差最大，B因素其次，D和C因素較小。表明，A因素對蛹蟲草培養(yǎng)基多肽提取率的影響最大，隨后為B因素、C因素和D因素。

方差分析結(jié)果顯示，A因素F值為75.206 6(F0.05F)，表明，3個因素的變化對多肽提取率的影響無顯著差異。按照不同因素k值的變化可知，A、B、C和D因素優(yōu)選水平分別為2、2、2和2或1，即超聲提取蛹蟲草培養(yǎng)基中多肽的條件為A2B2C2D2或A2B2C2D1，提取溶劑(蒸餾水)pH 8.5，料液比1∶15，超聲提取45 min，提取1～2次。

表1水超聲提取蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的L9(34)正交試驗方案與結(jié)果

Table 1 Orthogonal test scheme and results of L9(34) for extracting polypeptides fromC.militarisculture medium by ultrasound method

序號No.A(提取溶劑pH)Extraction solvent pHB(提取時間/min)Extraction timeC(料液比)Solid-liquid ratioD(提取次數(shù)/次)Extraction times提取率/%Extraction rate17.5301∶20319.6427.5451∶15221.3537.5601∶10119.3648.5301∶15121.8558.5451∶10322.0468.5601∶20222.2679.5301∶10217.3689.5451∶20118.5799.5601∶15318.05

表2 蛹蟲草培養(yǎng)基中多肽提取率的直觀分析

注：K，各因素某一水平結(jié)果之和；k，各因素某一水平結(jié)果之和平均值；S，偏差平方和。

Note:K, sum of results of a certain level of each factor;k, average sum of the results of a certain level of each factor;S, sum of squares of deviations.

3結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，蛹蟲草培養(yǎng)基多肽的超聲法提取效果均優(yōu)于相同條件下的熱回流法，說明，超聲提取法較傳統(tǒng)熱回流提取法節(jié)省溶劑消耗、節(jié)省生產(chǎn)用時和用工及操作簡單。蛹蟲草培養(yǎng)基多肽超聲提取最佳工藝參數(shù)：用pH 8.5的蒸餾水為提取溶劑，料液比1∶15，超聲提取45 min，提取1～2次。此技術(shù)條件下的提取率為21.85%～22.26%。該試驗為蛹蟲草的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)使用奠定了良好基礎(chǔ)，同時給蛹蟲草超聲提取提供了可借鑒的數(shù)據(jù)參考。