3種市售蚊香液對(duì)植物根尖細(xì)胞的遺傳損傷效應(yīng)

李 瑩，陳霞明，李函融，羅 特

(廈門大學(xué)嘉庚學(xué)院，河口生態(tài)安全與環(huán)境健康福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州 363105)

蚊香作為夏季驅(qū)蚊的主要產(chǎn)品，主要包括盤式蚊香、電熱蚊香片和電熱蚊香液3種劑型[1]，其中，電熱蚊香液由于其日揮發(fā)量小、有效成分穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)廣受消費(fèi)者的歡迎[2]。蚊香液包括殺蟲有效成分、溶劑、穩(wěn)定劑、恢散調(diào)整劑及香料等成分，其有效成分多以擬除蟲菊酯類為主[3]。然而，隨著擬除蟲菊酯類物質(zhì)的廣泛應(yīng)用，隨之帶來的農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重[4]。1998年，美國環(huán)境保護(hù)局(United States Environmental Protection Agency，USEPA)已將氰戊菊酯、氯氰菊酯和氯菊酯等擬除蟲菊酯類物質(zhì)列入67種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物黑名單[5]。研究指出，擬除蟲菊酯是一種重要的神經(jīng)毒劑，其作用機(jī)制與滴滴涕(dichloro diphenyl trichloroethane，DDT)類似，主要通過干擾神經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而產(chǎn)生毒性作用使害蟲致死[6]。同時(shí)，擬除蟲菊酯作為一類親脂性殺蟲劑，在水體中可直接進(jìn)入水生動(dòng)物的血液，并可在其體內(nèi)富集，引起中毒反應(yīng)[7]。研究發(fā)現(xiàn)氟氯氰菊酯污染物會(huì)影響草魚肝腎的生理功能[8]；聯(lián)苯菊酯和醚菊酯暴露下，對(duì)真鯛的安全濃度分別為0.12μg/L和0.02 mg/L，分別屬于劇毒和高毒物質(zhì)[9]；氰戊菊酯、溴氰菊酯對(duì)凡納對(duì)蝦的安全濃度分別為0.014和0.011μg/L，均屬于極高毒藥物[10]；溴氰菊酯暴露會(huì)導(dǎo)致淡水中華絨螯蟹肝胰腺M(fèi)DA含量增加，機(jī)體非特異性防御系統(tǒng)受到損傷，肝胰腺正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，屬于高毒物 質(zhì)[11]。研究還發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯在哺乳動(dòng)物體內(nèi)可以被相應(yīng)的酶類分解代謝，但其對(duì)哺乳動(dòng)物依然具有低毒性，存在致癌、致畸、致突變的潛在威脅[12]。馬拉硫磷、毒死蜱、氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯單獨(dú)與聯(lián)合經(jīng)口染毒均可致小鼠骨髓細(xì)胞微核率、精子畸形率增加，且聯(lián)合染毒對(duì)小鼠的遺傳損傷具有一定的相加作用，具有引起遺傳毒性的風(fēng)險(xiǎn)[13]；氟丙菊酯原藥對(duì)雄性大鼠經(jīng)口染毒劑量為3.91 mg/(kg·d)及以上，對(duì)雌性大鼠經(jīng)口染毒劑量為3.62 mg/(kg·d)及以上時(shí)，可產(chǎn)生毒性效應(yīng)[14]。對(duì)植物的研究發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷、毒死蜱、氰戊菊酯劑量濃度達(dá)到10μg/mL時(shí)，會(huì)對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞造成遺傳損傷[15]；13.65 mg/L的辛硫磷、25 mg/L的四聚乙醛對(duì)大蒜根尖細(xì)胞有較強(qiáng)的染色體致畸變作用[16]。目前，擬除蟲菊酯類物質(zhì)的使用量不斷增加，其可通過降雨徑流、大氣干濕沉降等途徑進(jìn)入土壤和水體，從而在水體及其底泥、農(nóng)林業(yè)用地的水及土壤中大量殘留[17]。為更全面地評(píng)估蚊香液的生物學(xué)作用，開展蚊香液對(duì)植物的遺傳毒性研究具有重要意義。

微核是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一，常被用來評(píng)價(jià)環(huán)境誘變因子對(duì)生物遺傳物質(zhì)的損傷程度[18]，具有靈敏、簡便、快速的特點(diǎn)，并與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果高度一致；植物根尖微核檢測技術(shù)已廣泛運(yùn)用于檢測環(huán)境污染物、常用農(nóng)藥等的致突變作用[19-20]。該研究以3種植物蠶豆、大蒜和洋蔥作為實(shí)驗(yàn)材料，分析不同濃度的蚊香液對(duì)植物根尖細(xì)胞微核率及微核指數(shù)的影響，探討蚊香液對(duì)不同植物遺傳損傷程度的差異，同時(shí)比較不同品牌蚊香液對(duì)植物細(xì)胞微核率的差異，以期為蚊香液的安全使用提供參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蠶豆種子，產(chǎn)自山東菏澤。普通大蒜、洋蔥、3種品牌蚊香液(BBN、JJ、YB，以品牌名稱首字母表示)，均購自福建省漳州市開發(fā)區(qū)南濱大道豐順超市；其中，BBN和JJ品牌蚊香液均標(biāo)明其有效成分為0.8%的氯氟醚菊酯，YB蚊香液標(biāo)明其“在農(nóng)藥登記證上列為微毒，是農(nóng)藥毒性評(píng)級(jí)的低級(jí)”，而未體現(xiàn)其具體有效成分。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蚊香處理液的制備 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制備不同濃度梯度的蚊香處理液，將3種品牌蚊香液均用蒸餾水分別稀釋4倍、2倍、1.33倍，振蕩搖勻，制備成體積濃度為25%、50%和75%的蚊香處理液，蒸餾水作為空白對(duì)照組。

1.2.2 微核試驗(yàn) 選取飽滿、均勻的蠶豆種子，同時(shí)選取長勢良好的大蒜和洋蔥，分別洗凈后置于裝有蒸餾水的燒杯和培養(yǎng)皿中，置于室溫(若室內(nèi)溫度低于25℃，需放入25℃的恒溫箱中)，浸泡24 h，此期間至少換水2次。隨后轉(zhuǎn)入裝有少量蒸餾水的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)催芽，保持濕度，浸泡24～48 h，期間換水4～6次，待種子生出根長至2～3 cm，選取初生根尖生長良好、根長一致的蠶豆種子、大蒜蒜瓣和洋蔥(每顆大蒜蒜瓣和每個(gè)洋蔥均有多個(gè)根尖)，各分為10組(蠶豆每組5～7粒，大蒜蒜瓣每組2～3顆，洋蔥每組1個(gè))，分別置于裝有不同蚊香處理液的30個(gè)發(fā)芽盒中，其中，每種植物需用3種蚊香液處理，每種蚊香液各設(shè)3個(gè)處理濃度，共計(jì)9個(gè)蚊香液處理組，再設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組。室溫下培養(yǎng)24 h，供試液需沒過完整根尖。將處理后的種子，用蒸餾水浸洗3～4次，從根尖頂端切下1 cm長的幼根放入抗生素空瓶中，加卡諾氏固定液(無水乙醇與冰醋酸按照體積比例3∶1配制)固定24 h，固定后的幼根如來不及制片時(shí)，可放入70%的乙醇中，置4℃冰箱內(nèi)待下次制片。

1.2.3 染色制片 取固定好的根尖，蒸餾水沖洗3 min，加入6 mol/L的鹽酸將幼根浸沒，室溫下酸解10 min，待幼根軟化即可。將解離后的幼根水洗3 min并吸干，挑取1個(gè)根尖的乳白色分生組織(大約1 mm左右，不宜過大)置于載玻片上夾碎搗爛，滴加1～2滴改良苯酚品紅染液，染色10～15 min。在經(jīng)染色的根尖上再加1滴染液，蓋上蓋玻片，覆1層吸水紙，將多余的改良苯酚品紅溶液吸去，用帶橡皮頭的鉛筆垂直地輕輕敲打蓋玻片，使根尖充分分散壓平，便于觀察微核。

1.2.4 鏡檢及微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn) 在低倍鏡下選擇細(xì)胞分散均勻、無損傷、染色良好的根尖分生區(qū)進(jìn)行觀察，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察記錄細(xì)胞的微核數(shù)量。微核的識(shí)別嚴(yán)格按照國家環(huán)保局植物根尖微核試驗(yàn)的規(guī)范方法[21]，在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核，小核著色與主核相當(dāng)或稍淺，小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則形。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組觀察6張玻片，選取其中4張計(jì)算平均微核率(micronucleus，MCN，‰)和微核指數(shù)(即污染指數(shù)，pollution index，PI)，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中的微核數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

MCN/‰=樣品檢出微核的細(xì)胞數(shù)/樣品檢測的細(xì)胞總數(shù)×1 000‰

所測樣品的MCN與對(duì)照比較，PI值≥1.5判斷樣品對(duì)植物造成遺傳損傷[21]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Excel 2013計(jì)算樣品的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 3種蚊香液處理植物根尖后細(xì)胞的微核觀察

鏡檢發(fā)現(xiàn)，3種蚊香處理液均可誘導(dǎo)植物根尖細(xì)胞產(chǎn)生微核，且均為單微核，這些微核結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的頻率與不同蚊香處理液濃度有一定的關(guān)系(圖1)。

圖1 蚊香液處理植物根尖細(xì)胞后的微核觀察

2.2 不同濃度的蚊香液對(duì)植物根尖細(xì)胞微核率的影響

如表1所示，BBN、JJ、YB 3種蚊香液的各濃度處理組與對(duì)照組相比，微核率均出現(xiàn)不同程度的增加，但僅75%濃度組的增量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各濃度處理組微核指數(shù)均≥1.5，表明對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞造成了一定的遺傳損傷。同種蚊香液不同濃度之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

如表2所示，3種蚊香液處理組與對(duì)照組相比，微核率有不同程度上升，但僅有JJ和YB蚊香液的75%濃度組與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。蚊香液各濃度組的微核指數(shù)均≥1.5，表明對(duì)大蒜根尖細(xì)胞均造成遺傳損傷。同種蚊香液不同濃度間比較，發(fā)現(xiàn)BBN和JJ蚊香液各濃度組處理的大蒜根尖，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；YB蚊香液的25%和75%濃度組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 不同濃度的蚊香液對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響(n=500)

表2 不同濃度的蚊香液對(duì)大蒜根尖細(xì)胞微核率的影響(n=500)

如表3所示，3種蚊香液處理組與對(duì)照組相比，微核率有不同程度的增加，與對(duì)照組相比，JJ和YB蚊香液的25%濃度組觀察到的微核數(shù)較少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其他濃度組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨蚊香液濃度增加，細(xì)胞微核數(shù)隨之增加，微核指數(shù)均≥1.5，即3種蚊香液對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞均具有致突變性。同種蚊香液不同濃度之間比較，均存在明顯差異(P＜0.05)。

表3 不同濃度的蚊香液對(duì)洋蔥根尖細(xì)胞微核率的影響(n=500)

2.3 3種植物根尖細(xì)胞微核率的對(duì)比

如圖2所示，BBN、JJ和YB蚊香液處理3種植物根尖，隨蚊香液濃度增加，蠶豆、大蒜和洋蔥的根尖細(xì)胞微核率均呈現(xiàn)增加趨勢，3種植物對(duì)照組微核率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，即排除試驗(yàn)方法等因素對(duì)3種植物細(xì)胞微核率的差異。JJ和YB蚊香液75%濃度組處理的洋蔥根尖細(xì)胞微核率高于對(duì)應(yīng)濃度的蠶豆根尖細(xì)胞微核率，差異顯著(P＜0.05)。

圖2 蚊香液對(duì)不同植物根尖細(xì)胞微核率對(duì)比

2.4 3種品牌蚊香液誘導(dǎo)植物根尖細(xì)胞損傷程度的對(duì)比

如圖3所示，3種品牌蚊香液作用于蠶豆、大蒜和洋蔥，產(chǎn)生了不同程度的遺傳損傷，微核率隨濃度變化具有一致的規(guī)律性。微核率在同一濃度3種蚊香液之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，總體表現(xiàn)為3種品牌蚊香液對(duì)實(shí)驗(yàn)植物根尖細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)差異較小。

圖3 3種品牌蚊香液對(duì)植物根尖細(xì)胞微核率影響的對(duì)比分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蚊香處理液作用于蠶豆、大蒜和洋蔥根尖細(xì)胞時(shí)，均可誘導(dǎo)植物根尖細(xì)胞產(chǎn)生微核現(xiàn)象，其微核率均高于對(duì)照組，且隨濃度的增加，蚊香液處理液誘導(dǎo)3種植物根尖細(xì)胞微核率也隨之增加，可能是由于高濃度蚊香液暴露使得細(xì)胞有絲分裂會(huì)受影響，紡錘體功能得不到正常發(fā)揮，從而影響DNA的復(fù)制，也可能在這種較高的濃度下，細(xì)胞的呼吸作用會(huì)受到抑制，影響了細(xì)胞生長。楊玉英研究了溴氰菊酯對(duì)紫露草根尖細(xì)胞的誘變作用，實(shí)驗(yàn)顯示在一定濃度范圍內(nèi)，溴氰菊酯水溶液浸泡可以使紫露草微核率升高，存在一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系[22]。卜寧等在農(nóng)藥氰戊菊酯和三氟氯氰菊酯對(duì)蠶豆的致突變研究中發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，蠶豆根尖細(xì)胞微核率會(huì)隨暴露濃度的升高而增加，同時(shí)，這兩類擬除蟲菊酯還可誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞產(chǎn)生較高頻率、多種類型的染色體畸變，對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞具有明顯的遺傳毒性[23]。以上研究均表明高濃度的污染物質(zhì)可以增加植物根尖細(xì)胞微核的產(chǎn)生，對(duì)植物的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的損傷。

本文研究還發(fā)現(xiàn)，蚊香液處理可以誘導(dǎo)蠶豆、大蒜和洋蔥根尖細(xì)胞微核的產(chǎn)生，說明蚊香液對(duì)植物可以產(chǎn)生一定的遺傳損傷。本研究中，同種實(shí)驗(yàn)條件下，高濃度(75%)的JJ和YB蚊香液誘導(dǎo)洋蔥根尖細(xì)胞微核率明顯高于蠶豆(P＜0.05)，而大蒜與二者均無顯著差異(P＞0.05)，且低(25%)、中(50%)濃度組的3種蚊香處理液誘導(dǎo)3種植物根尖細(xì)胞微核率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，表現(xiàn)為高濃度蚊香液暴露條件下，洋蔥較蠶豆更敏感，中、低濃度暴露對(duì)3種植物敏感性差異不大。有研究指出蠶豆根尖細(xì)胞周期中的大部分時(shí)間對(duì)誘變劑敏感，便于遺傳毒性的檢測[24]；而與蠶豆相比，大蒜和洋蔥作為可用鱗莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖的植物，其取材方便、遺傳性能穩(wěn)定，每瓣/個(gè)鱗莖可以發(fā)出數(shù)條不定根，用一瓣/個(gè)鱗莖作為一個(gè)處理可以消除不同個(gè)體處理間的個(gè)體差異，也常被作為微核試驗(yàn)材料[25-27]。本研究中，由于蠶豆、大蒜和洋蔥根尖細(xì)胞對(duì)蚊香液均具有較高的靈敏性，并在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)，因此，3種植物根尖細(xì)胞微核率在一定程度上可以反映蚊香液的污染程度，可用于蚊香液的污染檢測。

本研究以3種市面常用品牌的蚊香處理液對(duì)植物根尖進(jìn)行誘導(dǎo)，其微核率相差不大，未形成明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有研究指出，氯氟醚菊酯對(duì)淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)幼蟲和家蠅(Musca domestica)幼蟲的LC50分別為0.94μg/L和4.2μg/g，其防治效果優(yōu)于四氟甲醚菊酯、四氟苯菊酯和右旋炔丙菊酯這三類擬除蟲菊酯農(nóng)藥[28]。也有研究發(fā)現(xiàn)阿拉伯按蚊(Anopheles arabiensis)和白紋伊蚊(Aedes albopictus)在含0.08%氯氟醚菊酯的盤蚊香暴露1 h后，二者24 h的死亡率均超過90%[29]，而致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)的死亡率可達(dá)100%[30]。以上研究均表明氯氟醚菊酯類物質(zhì)對(duì)昆蟲表現(xiàn)出較高的毒殺活性。此外，將幼鼠暴露于0.08%氯氟醚菊酯電熱蚊香片后，其肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量、肝臟器系數(shù)、肝臟濕重均顯著升高，且肝細(xì)胞胞質(zhì)疏松、部分肝細(xì)胞腫脹、嗜堿性小體減少、肝索排列紊亂，表現(xiàn)為組織學(xué)異常，呈現(xiàn)出一定的肝臟毒性[31]。結(jié)合本研究，擬除蟲菊酯類物質(zhì)可以對(duì)動(dòng)植物產(chǎn)生一定的生物毒性，而市售不同品牌的蚊香產(chǎn)品之間毒性差異尚不明顯。