膠質芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵生產及結構鑒定

劉 爽，李 會，許椏楠，史勁松，許正宏

(1. 江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

細菌胞外多糖均具有獨特的理化性質、流變學特性及其生理活性，使其在食品、醫(yī)藥、生物選礦及污水處理等領域具有潛在的應用前景[1]。不同種類細胞的胞外多糖之間，單糖及重復單元構成存在較大差異，相關的功能也存在差異，如：細菌產海藻酸鈉可作為藥物在體內運輸?shù)奈⑤d體，制作牙模等[2]；腸膜狀明串珠菌所分泌的葡聚糖可用作血漿替代物，用以治療休克及失血[3]；鏈球菌分泌的透明質酸可以用于眼科藥品及人造皮膚[2]；Martin等[4]發(fā)現(xiàn)某些細菌胞外多糖具有安眠效果，可以消除失眠人群對于化學藥物的依賴；膠質芽孢桿菌胞外多糖不僅對改善免疫力具有顯著作用[5]，而且還具有解磷、解鉀的功能[6]。細菌胞外多糖還可作為單糖的來源，如L-巖藻糖、L-鼠李糖等都來源于大分子多糖。這一類單糖化學合成或從自然界動植物資源中提取成本過高且產量不足，卻有不可或缺的利用價值，因此，含有相應糖基的多糖則成為此類單糖的來源。如，肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌所分泌的胞外多糖，其中均富含巖藻糖成分，可作為巖藻糖的來源[7]。

盡管細菌胞外多糖的種類繁多，但其生物合成途徑卻存在較多相似之處[8]。Lee等[9]研究發(fā)現(xiàn)，較高的通氣量有利于多糖產量的提高及發(fā)酵液黏度的增大；Yang等[10]在發(fā)酵法制備芝多糖的研究中得到了相近的結果，較高的攪拌轉速和通氣速率對多糖的積累具有促進作用。多糖合成過程涉及一系列高耗能過程的氧化反應，為菌體自身生長及多糖合成提供所需能量。細菌胞外多糖的發(fā)酵過程對溶氧條件要求較高，在營養(yǎng)元素充足時，為菌體提供較好的溶氧條件將會促進多糖產量的提高[11]。目前對膠質芽孢桿菌胞外多糖的研究主要集中于菌株篩選及發(fā)酵工藝研究，但多糖產率較低，已報道的膠質芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵多采用分批發(fā)酵工藝，且產量較低，多數(shù)低于10 g/L[12-13]。細菌胞外多糖的合成分泌，將直接導致發(fā)酵體系的流變學特性發(fā)生改變。胞外多糖發(fā)酵過程中，發(fā)酵液黏度不斷增大，將會表現(xiàn)出非牛頓流體的特性或假塑性流體的特點，當發(fā)酵液體現(xiàn)為非牛頓流體的特性時，發(fā)酵液中的菌體會形成不同的形態(tài)，多糖的性質也將會出現(xiàn)差異[1]。

本研究團隊在前期工作中篩選獲得一株膠質芽孢桿菌SM-01，在生長過程中該菌株能夠產生一定含量的胞外多糖(BMPS)。為了進一步促進菌株生產胞外多糖的能力及應用范圍，本文中，筆者重點研究攪拌轉速和通氣量對膠質芽孢桿菌產胞外多糖的影響，并進一步對所發(fā)酵生產的胞外多糖進行分離純化，分析鑒定其多糖的結構組成，以期為膠質芽孢桿菌胞外多糖的工業(yè)化生產及應用開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

膠質芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)SM-01，保藏于中國菌種保藏中心，保藏號：CGMCC 5766。

斜面培養(yǎng)基(g/L)： K2HPO4·3H2O 0.2、蔗糖 10.0、NaCl 0.2、尿素 0.1、CaCO35.0、MgSO4·7H2O 0.2、瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 0.2、蔗糖 10.0、 NaCl 0.2、尿素 0.1、MgSO4·7H2O 0.2、CaCO35.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO4·3H2O 0.2、葡萄糖 60.0、MgSO4·7H2O 0.6、NaCl 0.4、尿素 0.3、CaCO35.0。

以上培養(yǎng)基都需調節(jié)pH至 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 膠質芽孢桿菌的培養(yǎng)

種子液培養(yǎng)：將斜面保藏的菌種接種至種子培養(yǎng)基中，置于150 r/min、 30 ℃搖床上培養(yǎng)。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積分數(shù)4%的接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床上，在150 r/min、30 ℃條件下進行培養(yǎng)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：將種子液以體積分數(shù)4%接種量接至5 L發(fā)酵罐中，裝液量3 L，培養(yǎng)溫度30 ℃，通氣量2 VVM(每分鐘通氣量與罐體實際料液體積比值)，攪拌轉速600 r/min(優(yōu)化攪拌轉速時換為其他攪拌轉速)。

1.2.2 分析方法

菌體濃度測定：取1 mL發(fā)酵液，加入等體積2%鹽酸，混勻，以除去殘留的CaCO3。將原液稀釋2～8倍后，分光光度計于600 nm波長處測定吸光值。

葡萄糖濃度測定：取2 mL發(fā)酵液，稀釋100倍后，13 000 r/min離心10 min，取上清液，生物傳感分析儀測定葡萄糖濃度。

粗多糖濃度測定：取15 mL發(fā)酵液，稀釋1～10倍后，13 000 r/min離心20 min，以除去CaCO3及菌體。取上清液，加入3倍體積無水乙醇，混勻，4 ℃沉淀10 h后，7 000 r/min離心15 min，棄上清得粗多糖。將粗多糖真空干燥至恒質量，然后用分析天平稱質量。

1.2.3 膠質芽孢桿菌胞外多糖粗提取工藝

以去離子水將發(fā)酵液稀釋10倍，13 000 r/min離心20 min，以去除殘留CaCO3及菌體。取上清液，旋轉蒸發(fā)濃縮儀將上清液濃縮。向濃縮液中加入3倍體積無水乙醇，混合均勻，4 ℃沉淀10 h。沉淀結束后，7 000 r/min離心15 min，取沉淀，即為粗多糖。粗多糖溶于去離子水中，以Sevrage法除蛋白，蛋白除凈后再次以無水乙醇沉淀獲取多糖。粗多糖冷凍干燥，樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 膠質芽孢桿菌胞外多糖分離純化

1)粗多糖溶液制備。稱取500 mg粗多糖，將其溶解于100 mL去離子水中，即為粗多糖溶液。

2)離子交換柱層析。安裝層析柱，將處理好的陰離子交換填料DEAE-52緩慢加入層析柱，至填料離上端5 cm左右。以0.02 mol/L的NaCl溶液進行平衡，流速1.2 mL/min。層析柱平衡完畢，將5 mL粗多糖溶液加入層析柱，用重蒸水以1.2 mL/min流速洗脫，將過量粗多糖洗脫。洗脫后分別以濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75及2.0 mol/L的NaCl溶液進行分階段洗脫，每一濃度洗脫5倍柱體積，流速1.2 mL/min。每隔2 min的洗脫液收集為1管，收集完畢以苯酚-H2SO4法測定多糖含量。

3)透析脫鹽。按照洗脫曲線合并洗脫液，以旋轉蒸發(fā)濃縮儀將洗脫液濃縮。濃縮液置于透析袋中，先以流水透析48 h，然后以去離子水透析48 h，每隔2 h將去離子水更換1次。透析結束后將多糖溶液濃縮，然后加入3倍體積無水乙醇，于4 ℃沉淀10 h。7 000 r/min離心15 min，獲取沉淀冷凍干燥即為純BMPS。

1.2.5 膠質芽孢桿菌胞外多糖純度檢驗

1)蛋白含量測定。以Braford蛋白測定試劑盒說明書所述流程進行操作，制作標準曲線。配制質量濃度為5.0 g/L的多糖溶液，并進行梯度稀釋，分別取不同質量濃度多糖溶液20 μL加入孔板。各孔中分別加入Braford 試劑200 μL，振蕩均勻，室溫靜置10 min。酶標儀測定A595，根據(jù)標準曲線計算多糖中蛋白含量。

2)全波長掃描。配制質量濃度為2.0 g/L的多糖溶液，以0.22 μm微孔濾膜進行過濾。紫外全波長掃描范圍200～800 nm。

3)凝膠滲透色譜。配制質量濃度為2.0 g/L的多糖溶液，以0.22 μm微孔濾膜進行過濾。濾液采用GPC-多角度激光散射聯(lián)用系統(tǒng)(GPC-MALLS)進行測定，色譜柱為Shodex OHpak SB-806 HQ，流動相為0.2 mol/L NaCl溶液，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃。此法可以同時檢測多糖分子量。

1.2.6 膠質芽孢桿菌胞外多糖結構初步分析

1)紅外光譜分析。取10.0 mg膠質芽孢桿菌胞外多糖樣品置于瑪瑙研缽中，加入500.0 mg KBr干粉末，充分研磨。用壓片機將研磨粉末壓制成薄片，薄片厚度控制在0.6～0.8 mm。紅外光譜掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1。

2)單糖組成分析。參照文獻[14]的方法測定單糖組成。

3)糖醛酸含量測定。參照文獻[15]的方法，制作葡萄糖醛酸標準曲線

1.2.7 樣品中糖醛酸含量測定

取質量濃度5.0 g/L的膠質芽孢桿菌胞外多糖溶液，進行梯度稀釋。按照標準曲線操作流程重復，于波長525 nm處測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算BMPS中糖醛酸含量。

2 結果與討論

2.1 5 L發(fā)酵罐中膠質芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵生產

在膠質芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵過程中，隨著菌體生長，多糖逐漸積累，發(fā)酵液黏度逐漸提高，發(fā)酵液中傳氧、傳質效果較差，從而限制了多糖的進一步積累[16]。在前期研究中，已對膠質芽孢桿菌SM-01搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化(數(shù)據(jù)未顯示)，但由于搖瓶發(fā)酵本身存在較多限制條件，隨著發(fā)酵液黏度增大，搖瓶發(fā)酵體系中傳氧、傳質效果變差且沒有良好的應對措施，嚴重阻礙了膠質芽孢桿菌胞外多糖進一步積累。為了進一步促進多糖的工業(yè)化生產，筆者在5 L發(fā)酵罐進行了膠質芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵研究。

2.1.1 攪拌轉速對膠質芽孢桿菌產BMPS的影響

攪拌轉速是細菌胞外多糖發(fā)酵過程中一個至關重要的因素。適宜的攪拌轉速會保證良好的傳氧，充足的溶氧能夠為胞外多糖的合成提供能量供給，而均勻攪拌所達到的傳質效果，能夠使菌體與各種營養(yǎng)物質良好的接觸，促進各種營養(yǎng)元素的快速攝取，以提高菌體生長速率及胞外多糖合成速率。因此，考察不同攪拌轉速對發(fā)酵體系中多糖濃度及OD600的影響，結果見圖1。

圖1 攪拌轉速對菌體生長和多糖濃度的影響Fig.1 Effects of agitation speed on cell growth and polysaccharide concentration

由圖1可知：當轉速為100 r/min時，多糖質量濃度最低，且此時OD600也最低；隨著攪拌轉速增大，胞外多糖濃度及OD600隨之提高，并于轉速為600 r/min時多糖濃度及OD600達到最高，分別為25.9 g/L及3.1；當轉速超過600 r/min時，多糖濃度及OD600均隨轉速的升高而降低。發(fā)酵罐攪拌轉速的提高會提升膠質芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵過程中傳氧、傳質速率，保證了發(fā)酵過程中能量與營養(yǎng)元素的充足供應，因此在轉速為100～600 r/min時，隨著攪拌轉速提高，多糖濃度及菌體濃度也隨之升高。此外，BMPS溶液為假塑性流體，發(fā)酵體系中剪切速率隨攪拌轉速的提高而增大，使得發(fā)酵液表觀黏度下降。發(fā)酵液黏度下降對發(fā)酵過程中的傳氧、傳質效果具有促進作用，進而促進菌體生長及多糖合成。但當攪拌速度過高時，過高的剪切速率反而會對菌體正常生長及代謝活動帶來傷害，因此在轉速為600～700 r/min時，OD600隨轉速的升高而降低，最終導致多糖合成效率降低。

2.1.2 通氣量對膠質芽孢桿菌產胞外多糖的影響

溶氧是胞外多糖發(fā)酵過程中一個重要環(huán)境因子。菌體自身生長代謝活動及胞外多糖合成過程都是耗能過程，會涉及一系列氧化反應。在膠質芽孢桿菌SM-01胞內，分子氧既可作為最終電子受體，又可作為菌體內某些化合物的結構成分?？疾觳煌饬繉w生長及多糖合成的影響，結果見圖2。

圖2 通氣量對菌體生長和多糖濃度的影響Fig.2 Effects of aeration rate on cell growth and polysaccharide concentration

由圖2可知：當通氣量為0.5 VVM時，胞外多糖濃度及菌體濃度最低；通氣量為0.5～2.0 VVM時，發(fā)酵液中溶氧水平隨通氣量升高而升高，與此同時，菌體濃度及多糖濃度均有所提高并于通氣量為2.0 VVM時，多糖質量濃度及OD600達到最高值，分別為29.8 g/L及2.3；當通氣量為2.5 VVM時，OD600及多糖濃度都開始下降。這是因為分子氧對菌體而言，除了作為最終電子受體外，還能夠產生對生物體有毒害作用的物質，如超氧基化合物及H2O2，這2種物質在互相作用時會產生毒性更強的自由基·OH，不利于菌體的生長及胞外多糖的合成。

2.2 膠質芽孢桿菌胞外多糖的分離純化結果

2.2.1 粗多糖的制備

經離心、濃縮、去蛋白、醇沉、干燥后得到的粗多糖樣品(圖3)。將粗多糖溶解于去離子水中得到粗多糖溶液，光學顯微鏡檢測結果顯示并無菌體存在，表明多糖中已不含菌體。

圖3 粗多糖樣品Fig.3 Crude polysaccharide

2.2.2 膠質芽孢桿菌胞外多糖分離純化

細菌胞外多糖為長鏈大分子結構，除寡糖重復單元聚合而成的主鏈之外，在多糖的主鏈之上還有較多側鏈及基團。這些側鏈及基團一般為帶電子結構，能對胞外多糖與其他多糖復配時的作用效果產生影響，而細菌胞外多糖的吸附能力也主要取決于這些側鏈修飾結構。一般而言，細菌胞外多糖為單一組分時，其側鏈帶電基團基本一致，不同多糖結構中，側鏈帶點基團間的差異決定了其與離子交換層析中所用填料之間結合程度的差異?；谶@一特性，可利用離子交換柱層析將細菌胞外不同組分的多糖分離純化。

選取用DEAE-52離子交換柱層析純化膠質芽孢桿菌胞外多糖。以不同濃度的NaCl溶液作為洗脫液進行分階段洗脫，結果如圖4。

圖4 DEAE離子交換柱層析Fig.4 Chromatography on DEAE ion exchange column

由圖4可知：當洗脫液為0.5 mol/L NaCl溶液時出現(xiàn)洗脫峰，其他濃度NaCl溶液洗脫時均無明顯洗脫峰出現(xiàn)。當洗脫液用量為40 mL時，出現(xiàn)峰形對稱的洗脫峰，表明在該條件下所得多糖為單一組分。

洗脫得到的洗脫液，用透析法除去多糖中的無機鹽離子及殘留的各種小分子雜質后濃縮體積，以3倍體積無水乙醇4 ℃沉淀10 h，離心后冷凍干燥獲得多糖樣品。

2.2.3 膠質芽孢桿菌胞外多糖純度檢測結果

1)紫外全波長掃描及蛋白含量測定。對質量濃度為0.5 mg/mL的純化多糖溶液進行紫外全波長掃描分析，結果如圖5。由圖5可知：該多糖溶液只在200 nm左右出現(xiàn)多糖類物質特征吸收峰，260、280 nm處均沒有特征吸收峰，表明純化過后的多糖中核酸及蛋白含量較低，多糖純度較高。進一步對蛋白含量進行測定結果表明，純化的多糖樣品中蛋白質含量僅為0.9%，與紫外全波長掃描結果一致。

圖5 紫外全波長掃描Fig.5 Ultraviolet full spectrum

2)凝膠滲透色譜。細菌胞外多糖為大分子化合物，其純度檢驗的標準及方法與小分子化合物的標準及方法存在較大差異。多糖純度檢驗通常有4種方式：超速離心法、高壓電泳法、比旋度法和凝膠過濾法。凝膠過濾法是目前應用較為廣泛且準確的方法，其原理為不同性狀及分子量的多糖在不同大小孔徑凝膠中的遷移速率存在差異，分子量較小的多糖在過濾過程中進入凝膠孔徑中，因此遷移速率相對較慢，而分子量較大的多糖則具有較快的遷移速率，若經檢測器檢測到單一對稱的峰，即可認為此多糖為單一組分。

本研究中，膠質芽孢桿菌胞外多糖經過離子交換柱層析等一系列分離純化過程后，凝膠滲透色譜檢測結果顯示只有一個單一對稱的峰出現(xiàn)(圖6)，表明得到的多糖純度較高，為單一組分。

圖6 凝膠滲透色譜分析圖譜Fig.6 Analysis results of gel permeation chromatographic

2.3 膠質芽孢桿菌胞外多糖的結構初步分析結果

2.3.1 膠質芽孢桿菌胞外多糖的紅外光譜分析

采用紅外光譜掃描對純化得到的膠質芽孢桿菌胞外多糖進行分析，結果見圖7，將圖7(a)中2 000～400 cm-1位置放大，得到圖7(b)。由圖7可知：1 413及1 600 cm-1為羧酸伸縮振動峰，說明多糖中有羧基存在，由此初步判定膠質芽孢桿菌胞外多糖為酸性糖；1 400～1 200及2 800～3 000 cm-1為亞甲基伸縮振動峰，是糖類化合物的特征吸收；3 405 cm-1為羥基伸縮振動峰，此測定結果與李潔等[14]對膠質芽孢桿菌胞外多糖的研究結果基本一致。

圖7 胞外多糖紅外光譜分析Fig.7 Infrared spectrum analysis of EPS

2.3.2 糖醛酸含量測定

較多細菌胞外多糖中都存在己糖醛酸，其可與四硼酸鈉-硫酸作用后再與間羥基聯(lián)苯互相作用產生有色物質，該有色物質最大吸收波長為525 nm，且525 nm處吸光值大小與糖醛酸含量之間具有良好線性關系。因此本研究以此法測定BMPS中糖醛酸含量，結果顯示糖醛酸在BMPS中含量為24.6%。結合紅外光譜分析結果可認定膠質芽孢桿菌胞外多糖為一種酸性多糖。離子色譜測定結果顯示酸性糖為葡萄糖醛酸。

2.3.3 分子量測定

細菌胞外多糖分子量測定是多糖性質研究工作中一個重要方面。細菌胞外多糖的性質與其分子量之間存在密切的聯(lián)系。如多糖水溶液黏度，其黏度不僅與多糖在水溶液中的濃度有關，還與多糖分子量存在關系。一般情況下，多糖水溶液黏度與其分子量之間呈正相關關系。不同分子量大小的多糖之間性質也存在差異，因此在細菌胞外多糖應用中，時常根據(jù)其具體應用要求選取合適分子量的多糖。

本研究中以凝膠滲透色譜檢驗多糖純度的同時，可測定其分子量(圖6)。經測定，膠質芽孢桿菌胞外多糖平均分子量為4.4×106，這一測定結果與李潔等[14]所測定膠質芽孢桿菌胞外多糖分子量處于同一數(shù)量級。

2.3.4 單糖組成測定

利用氣相色譜檢測單糖組成，結果見圖8。

1—鼠李糖；2—半乳糖；3—木糖；4—甘露糖；5—葡萄糖；6—半乳糖；7—肌醇圖8 單糖組成氣相色譜圖Fig.8 GC chromatogram of monosaccharides

由圖8可知：分離得到的BMPS單糖由葡萄糖、甘露糖及半乳糖構成，摩爾比為3.2∶ 2.2∶ 1，單糖種類與李潔等[14]測定結果相同，但各單糖摩爾比存在差異。李潔等[14]以蔗糖為碳源對膠質芽孢桿菌進行培養(yǎng)，而本文筆者所用碳源為葡萄糖，推測碳源的差異是BMPS中單糖比例發(fā)生改變的原因。

3 結論

通過對5 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程攪拌轉速及通氣量對膠質芽孢桿菌產胞外多糖的影響，最終確定了最適攪拌轉速和通氣量，并對胞外多糖BMPS進行分離純化及初步結構分析。通過除菌體、除蛋白等粗提取工藝，進而以離子交換柱層析、透析脫鹽等精細純化過程，獲得膠質芽孢桿菌胞外多糖BMPS純品，經純度檢驗其純度較高，為蛋白質含量僅為0.9%的高純度細菌胞外多糖，可用于后續(xù)研究。采用紫外全波長掃描、紅外光譜分析、氣相色譜分析、凝膠滲透色譜分析等技術對BMPS結構進行初步解析，確定了所得膠質芽孢桿菌胞外多糖為糖醛酸含量為24.6%的酸性糖，平均分子量為4.4×106，由葡萄糖、甘露糖及半乳糖構成，摩爾比為3.2∶ 2.2∶ 1。

國內已有膠質芽孢桿菌胞外多糖結構的相關研究報道。本文所研究的胞外多糖BMPS與已報道多糖相比，分子量處于同一數(shù)量級，但單糖組成有所差異，這可能是培養(yǎng)條件及營養(yǎng)因素不同引起。后續(xù)將在上述工作基礎上，結合京都基因與基因組百科全書(KEGG)中膠質芽孢桿菌的中心代謝途徑，解析以葡萄糖為碳源時菌體的胞外多糖生物合成途徑，從而為代謝工程手段改造膠質芽孢桿菌提高胞外多糖合成效率提供理論基礎。