紅冬孢酵母分子遺傳操作技術(shù)研究進(jìn)展

馬冬石，陳 震，彭毅雯，聞志強(qiáng)，金明杰

(南京理工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇 南京 210094)

紅冬孢酵母(Rhodosporidium)屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，是目前研究比較熱門的一類產(chǎn)油酵母[1]。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下(加上營養(yǎng)限制或者環(huán)境脅迫)，紅冬孢酵母的胞內(nèi)油脂含量可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的70%[2]。另外，它還能高效合成類胡蘿卜素，積累量甚至可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的36.2%[3]。該菌具有顯著的工業(yè)微生物特征，如，能廣泛利用各種碳源(包括己糖和戊糖)和氮源、可高密度培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)(可直接發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解液)等[4]。自20世紀(jì)50年代以來，紅冬孢酵母一直被認(rèn)為是重要的能源微生物和潛在的萜類化合物細(xì)胞工廠。

過去數(shù)十年中，該菌的研究主要集中在應(yīng)用開發(fā)和生物加工過程控制等方面。近年來，隨著環(huán)保壓力的加大和化石燃料價(jià)格走高，利用代謝工程、合成生物學(xué)技術(shù)開發(fā)“加強(qiáng)版”紅冬孢酵母生產(chǎn)可再生燃料和綠色化學(xué)品成為迫切需求。然而，由于遺傳背景不清晰和分子操作技術(shù)匱乏，該菌的遺傳改造一直進(jìn)展緩慢。2012年，大連化物所趙宗保課題組的Zhu等[5]率先對圓紅冬孢酵母(RhodosporidiumtoruloidesNP11)進(jìn)行了測序，公布了圓紅冬孢酵母的全基因組序列，這使得從分子水平深入研究該類微生物成為可能。此后，針對紅冬孢酵母的組學(xué)研究、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、基因元件挖掘及遺傳操作工具開發(fā)等開始出現(xiàn)并蓬勃發(fā)展。

組學(xué)的研究一定程度上促進(jìn)了紅冬孢酵母合成生物學(xué)元件(如復(fù)制子、啟動子、終止子和篩選標(biāo)記等)的挖掘，但尚未發(fā)現(xiàn)在紅冬孢酵母中有功能的復(fù)制元件。目前，紅冬孢酵母的遺傳操作載體一般為線性DNA片段、自殺質(zhì)?；蛘逿-DNA質(zhì)粒(主要配合根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化Agrobacteriumtumefaciensmediated transformation(ATMT)使用)。由于紅冬孢酵母同源重組效率較低，外源基因的定點(diǎn)整合、靶基因無痕敲除的成功報(bào)道很少，缺乏成熟的遺傳操作技術(shù)已成為紅冬孢酵母代謝工程改造為“細(xì)胞工廠”的主要障礙[1,4]。本文中，筆者對紅冬孢酵母分子遺傳操作技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了梳理和歸納，以期為該菌分子遺傳改造研究指明方向。

圖1 紅冬孢酵母分子遺傳操作工具技術(shù)Fig.1 Genetic technique development of Rhodosporidium

1 更多的合成生物學(xué)元件有待挖掘、表征和應(yīng)用

合成生物學(xué)元件是遺傳操作工具的重要組成部分。新元件的挖掘和應(yīng)用有望持續(xù)改善遺傳操作技術(shù)的效率。同其他真核生物一樣，紅冬孢酵母中的基因表達(dá)模塊結(jié)構(gòu)也是“啟動子-功能基因-終止子”，其中的“功能基因”包括篩選標(biāo)記、報(bào)告基因等元件(圖1)。過去數(shù)十年的研究已經(jīng)積累了一批啟動子、終止子、篩選標(biāo)記和報(bào)告基因等載體元件，這些亦可用于紅冬孢酵母。

紅冬孢酵母中可用的啟動子元件基本上是通過挖掘其基因組而得到，分為組成型和誘導(dǎo)型2種。Wang等[6]以潮霉素抗性梯度和潮霉素基因轉(zhuǎn)錄水平為評價(jià)依據(jù)，基本上確定了R.toruloidesY4中的PPGI、PPGK、PFBA、PTPI和PGPD等組成型啟動子的強(qiáng)弱排序。Liu等[7]鑒定了R.toruloidesATCC 10657的PGPD1啟動子，并以熒光素酶為報(bào)告基因表征了圓紅冬孢酵母油脂合成的6個重要基因啟動子，包括PACC1、PACL1、PFAS1、PFAT1、PDUR1和PLDP1等[8]。其中，PLDP1啟動子的強(qiáng)度是PGPD1啟動子的4～11倍，而PGPD1啟動子普遍被認(rèn)為是酵母中最強(qiáng)的啟動子之一。此外，他們還開發(fā)了一個可被D-氨基酸嚴(yán)謹(jǐn)誘導(dǎo)的PDAO1啟動子系統(tǒng)[9]，此系統(tǒng)依賴于誘導(dǎo)物(如D-丙氨酸)濃度，在D-氨基酸誘導(dǎo)下,PDAO1啟動子可增強(qiáng)10倍，有很好的應(yīng)用潛力。在其他研究中，馬斯佳[10]鑒定了受磷酸鹽濃度嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)節(jié)的啟動子PPHO89，受葡萄糖濃度嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)節(jié)的啟動子PADH2和PGAL1;而Johns等[11]鑒定和表征了PNAR1、PICL1、PCTR3和PMET16等誘導(dǎo)型啟動子，充實(shí)了可調(diào)節(jié)元件的工具箱。

在酵母中，終止子通常是基因終止密碼子下游的一段長度在數(shù)百堿基以內(nèi)可以發(fā)揮終止其mRNA轉(zhuǎn)錄作用的序列，一般含有(T-rich)..TA (T) GT..(AT-rich)..TTT和TTTTTATA 特征序列。目前已有多種紅冬孢酵母的內(nèi)源終止子用于異源基因的表達(dá)，如Thsp、Tgpd等[12]，同時還發(fā)現(xiàn)某些來自花椰菜花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus)的終止子T35s和來自根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的終止子Tnos也能在紅冬孢酵母中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄終止功能[13]。

完善的載體系統(tǒng)還需要有效的篩選標(biāo)記和報(bào)告基因。酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中常用的篩選標(biāo)記有營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和抗生素抗性篩選標(biāo)記。目前在紅冬孢酵母中，可用的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記僅有URA3[14]和LEU2[15]，而抗性標(biāo)記有HYG、BLE、NAT和G418等[12-13]。多輪的抗性標(biāo)記表達(dá)盒整合實(shí)驗(yàn)表明[13]，HYG、BLE和NAT這3種標(biāo)記甚至可同時在該菌中發(fā)揮作用，使突變株可同時耐受多種抗生素。報(bào)告基因如熒光素酶(luciferase)、(增強(qiáng)型)綠色熒光蛋白(GFP)等也開始被用于啟動子表征和菌株篩選中[7,9]。

總體來說，紅冬孢酵母的元件仍不豐富，如在釀酒酵母中常用的RNA聚合酶Ⅲ型啟動子(可啟動sgRNA這樣的小RNA)以及YFP、RFP、CFP和HIS等報(bào)告基因或營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記仍有待開發(fā)、驗(yàn)證。另外，核定位信號(nuclear localization sequence，NLS)作為基因編輯系統(tǒng)的重要元件，也有待鑒定和表征[16]。因此，繼續(xù)嘗試引進(jìn)和挖掘新的基因元件仍然十分迫切。

2 外源基因轉(zhuǎn)化步驟繁瑣且轉(zhuǎn)化率低

高效、可靠的外源基因轉(zhuǎn)化方法及遺傳操作技術(shù)是工業(yè)微生物代謝工程改造的前提條件。目前尚未在紅冬孢酵母中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生性游離質(zhì)粒，也沒有證實(shí)任何染色體自主復(fù)制序列(autonomously replicating sequence，ARS)或著絲粒(CEN)序列可作為游離質(zhì)粒的復(fù)制元件在紅冬孢酵母中有功能[17]。因此，紅冬孢酵母的轉(zhuǎn)化載體基本上都是整合型的。

紅冬孢酵母的外源基因轉(zhuǎn)化研究始于1985年。Tully等[15]報(bào)道稱聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化可將苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)基因隨機(jī)整合至該菌的染色體上，1 μg DNA約轉(zhuǎn)化1 000轉(zhuǎn)化子。由于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法對高度依賴于菌株的原生質(zhì)體制備操作繁瑣，后續(xù)研究開始轉(zhuǎn)向根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法(ATMT)[7,12]。ATMT轉(zhuǎn)化適用于各種紅冬孢酵母，但轉(zhuǎn)化效率隨著篩選標(biāo)記的不同而有所不同，轉(zhuǎn)化效率從70至1 000轉(zhuǎn)化子(以一個轉(zhuǎn)化平板計(jì)算)[7]。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化操作簡單，但過程繁瑣，從構(gòu)建質(zhì)粒、制備供體農(nóng)桿菌到紅冬孢酵母轉(zhuǎn)化子篩選完成，耗時近2周。乙酸鋰/聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法也被嘗試用于R.toruloidesDMKU3-TK16的轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化方法非常簡便，易于操作，但轉(zhuǎn)化效率仍然偏低，1 μg DNA僅轉(zhuǎn)化25 轉(zhuǎn)化子[18]。最近，電轉(zhuǎn)化已經(jīng)被發(fā)展成為一種新的紅冬孢酵母轉(zhuǎn)化方法[17,19]，不同菌株的轉(zhuǎn)化率亦不同，其轉(zhuǎn)化效率為40～1 000 CFU(以1 μg DNA計(jì))不等?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化代表了紅冬孢酵母轉(zhuǎn)化研究的新方向，但轉(zhuǎn)化效率仍有待提高。

目前，ATMT仍然是最可靠和主流的研究方法[1]，但問題是T-DNA是大概率地以非同源末端連接(non-homologous end joining， NHEJ)隨機(jī)插入的方式被整合到基因組上，而不是以游離狀態(tài)與染色體上靶標(biāo)基因進(jìn)行同源重組，這導(dǎo)致了轉(zhuǎn)化子中發(fā)生過同源重組的突變株比例極低，必須開發(fā)出合適的方法有效過濾掉隨機(jī)插入導(dǎo)致的突變株。在T-DNA中攜帶致死基因負(fù)篩選標(biāo)記，使隨機(jī)插入突變株無法在篩選培養(yǎng)基中生長是1種較好的過濾策略。該方法已經(jīng)在不少真菌(如大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae))中嘗試成功，可為紅冬孢酵母的ATMT轉(zhuǎn)化提供借鑒[20]。

另外，低的轉(zhuǎn)化率仍然是所有轉(zhuǎn)化方法的痛點(diǎn)。目前紅冬孢酵母的轉(zhuǎn)化效率最高在103轉(zhuǎn)化子(以1 μg DNA計(jì))(或105個細(xì)胞)級別，這使得依賴于高轉(zhuǎn)化效率的遺傳操作工具如轉(zhuǎn)座子突變等可能無法使用。同時也意味著，當(dāng)出現(xiàn)頻率低于1/1 000時，正轉(zhuǎn)化子仍然很難獲得。因此需要耗費(fèi)大量的人力、物力來增加總轉(zhuǎn)化子數(shù)量，同時還要借助反篩標(biāo)記或其他方法過濾掉大量的背景菌株。由此可知，優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件及篩選復(fù)制子仍是突破轉(zhuǎn)化效率瓶頸的重點(diǎn)方向。

3 遺傳操作工具開發(fā)進(jìn)展緩慢

科學(xué)家在紅冬孢酵母中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了初步的外源基因的過表達(dá)或者內(nèi)源的有特殊表型的基因(便于篩選)的插入失活，但存在基因元件使用效率低、精準(zhǔn)的定點(diǎn)整合或者基于同源重組的基因刪除操作還不能有效開展等問題。

由于尚無游離質(zhì)粒可用，目前的紅冬孢酵母轉(zhuǎn)化載體主要是線性DNA、Ti質(zhì)?；蛘咦詺①|(zhì)粒等整合型載體。這意味著非整合元件在細(xì)胞內(nèi)的作用時間較短(一個細(xì)胞分裂周期)，效率也就不可能高。而某些得重復(fù)使用的整合元件(如抗性標(biāo)記等)則必須回收。鑒于此，孫文怡[16]證實(shí)Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)和FLP/FRT重組酶系統(tǒng)在紅冬孢酵母中可用，并用FLP/FRT系統(tǒng)回收抗性marker，實(shí)現(xiàn)了外源基因的多輪隨機(jī)整合。另外，歸巢內(nèi)切酶Ⅰ——sceⅠ也可以被用于重要篩選標(biāo)記的回收[21]。

精確的遺傳改造的另一個挑戰(zhàn)是圓紅冬孢酵母的同源重組效率較低。Sun等[22]以ATMT轉(zhuǎn)化八氫番茄紅素脫氫酶基因CRT1的同源重組敲除盒，測試出R.toruloidesNP11的同源重組效率約為2%。Koh等[23]利用ATMT轉(zhuǎn)化敲除盒以同源重組方式敲除CAR2基因(編碼胡蘿卜素環(huán)化酶)時，敲除株僅占全部轉(zhuǎn)化子的10.5%，而以Ku70基因(編碼KU70/80異質(zhì)二聚體中的一個亞基敲除后，菌株的非同源末端連接效率降低)敲除株為底盤細(xì)胞時，CAR2基因的同源重組敲除率(敲除株占全部轉(zhuǎn)化子比例)大幅提升至75.3%，不過總轉(zhuǎn)化子數(shù)量下降約一個數(shù)量級。這說明Ku70的敲除雖降低了T-DNA隨機(jī)插入染色體的能力，過濾掉了大量的隨機(jī)插入突變株(從6 152下降至885)，從而減少了正突變株的篩選工作量，但對同源重組效率的提升貢獻(xiàn)有限。因此，必須挖掘紅冬孢酵母的內(nèi)源同源重組元件并加以強(qiáng)化，或者引入外源的同源重組元件來提升該菌的同源重組效率，促進(jìn)遺傳操作工具開發(fā)和應(yīng)用。

低的同源重組效率以及低的轉(zhuǎn)化效率和載體元件效率共同限制了基于同源重組的遺傳操作工具的使用。目前熱門的CRISPR/Cas系統(tǒng)尚未在紅冬孢酵母中成功應(yīng)用，且報(bào)道非常少，推測原因可能有：1)缺少復(fù)制子，使得CRISPR/Cas系統(tǒng)的部分元件(如游離時起作用的同源臂、轉(zhuǎn)錄后成熟的sgRNA等)只能是在一個細(xì)胞分裂周期內(nèi)起作用；2)低的同源重組效率使得DNA雙鍵斷裂并修復(fù)成功的概率較低；3)低的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)一步降低了正轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的可能性。

4 總結(jié)與展望

最近幾年，紅冬孢酵母因其生理、代謝特性和應(yīng)用開發(fā)潛力引起了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的廣泛興趣。系統(tǒng)生物學(xué)(包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué))已經(jīng)基本上闡明了紅冬孢酵母基因組的組成、代謝途徑及其生理和對環(huán)境壓力響應(yīng)的分子機(jī)制，同時也輔助挖掘和表征了不少內(nèi)源的基因元件(啟動子、篩選標(biāo)記和終止子等)。新的轉(zhuǎn)化方法(如化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化)的出現(xiàn)和發(fā)展，一定程度上加速了紅冬孢酵母的功能基因鑒定和代謝工程改造研究。另外，很多在釀酒酵母或者解脂耶氏酵母中已經(jīng)應(yīng)用的轉(zhuǎn)化方法、遺傳工具、篩選標(biāo)記或者報(bào)告系統(tǒng)已經(jīng)被引入紅冬孢酵母。遺憾的是，同源重組效率低以及尚無可用的游離質(zhì)粒限制了目的基因的靶向插入和精確敲除。缺乏高效、精確的基因組編輯技術(shù)仍是紅冬孢酵母平臺菌株開發(fā)的一大障礙。

在合成生物學(xué)時代，以人工智能挖掘海量的組學(xué)數(shù)據(jù)，豐富紅冬孢酵母的基因元件庫，同時引入已在其他微生物如解脂耶氏酵母、釀酒酵母中成功應(yīng)用的遺傳技術(shù)，新的合成生物學(xué)工具(如CRISPR/Cas系統(tǒng))應(yīng)用成果有望很快面世。新一代的生物鑄造技術(shù)結(jié)合自動化的高通量平臺，將改寫紅冬孢酵母的分子遺傳改造研究格局，持續(xù)推動其學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的開發(fā)。