少花蒺藜草在中國北方地區(qū)的不同種群遺傳多樣性分析

宋振，張衍雷，付衛(wèi)東，張瑞海，張國良

中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081

少花蒺藜草在分類學上屬于禾本科（Gramineae）、蒺藜草屬（Cenchrussp.），原產(chǎn)于北美洲及熱帶沿海地區(qū)（Matocha et al.，2010；周立業(yè)等，2014）。少花蒺藜草可以作為一種牧草，然而其刺苞表面密被許多小刺，因此會對人及牲畜造成傷害，影響農(nóng)牧生產(chǎn)。少花蒺藜草適應性強，具有耐旱、抗寒、耐貧瘠和繁殖能力強等特點，尤其在沙漠地帶也可以生長繁衍，對沙漠化治理和生態(tài)恢復建設具有重要的意義；同時其適應性強、繁殖擴散快的特點也會使其入侵到農(nóng)田和牧場造成危害，成為一種很難根絕的雜草（張婷等，2017；張衍雷等，2015）。少花蒺藜草大約在20世紀40年代后期入侵到中國，但其入侵原因尚不確定，有學者認為是在二戰(zhàn)期間由日本人在東北地區(qū)墾殖時人為帶入，還有觀點認為少花蒺藜草是在中國北方進行牧草引種時隨貨物流入（安瑞軍等，2015；齊鳳林等，2011）。少花蒺藜草入侵后迅速繁殖蔓延，目前在中國北方農(nóng)牧交錯帶干旱半干旱沙地分布廣泛。很多研究人員發(fā)現(xiàn)，在此地區(qū)的蒺藜草屬雜草根據(jù)表型主要分為兩種：一種直立生長（直立型），一種匍匐生長（匍匐型）。國內(nèi)學者對這兩種類似的蒺藜草屬植物是否為同一物種觀點不一，甚至對少花蒺藜草稱謂和拉丁名也存在爭議，有人認為是同一物種的不同表型變異，也有人認為為同一屬的兩個不同種（安瑞軍，2013；徐軍等，2011）。《中國植物志》（中國科學院中國植物志委員會，1990）等權威文獻中關于蒺藜草屬植物形態(tài)學的具體細節(jié)描述認為，入侵中國北方地區(qū)的兩種表型蒺藜草屬植物分別為少花蒺藜草（C.spinifex）和蒺藜草（C.echinatus），是不同的兩個種。兩種植物的表型差異主要有以下兩點：（1）蒺藜草植株無分蘗或分蘗較少，表現(xiàn)為直立生長，而少花蒺藜草植株分蘗數(shù)量較多，表現(xiàn)為匍匐生長；（2）蒺藜草刺苞上剛毛輪狀著生，刺苞背部具較密的細毛和長綿毛，而少花蒺藜草刺苞幾乎無毛。但是表型的差異可能是由于環(huán)境因素等條件造成的，并不能完全確定二者是否為相同的種。

入侵生物的種類和數(shù)量具有顯著的地理區(qū)域性和時間動態(tài)性，而同一物種在不同環(huán)境條件下的生長也會產(chǎn)生較大的表型可塑性差異（齊艷紅等，2004；黃成成等，2018）。研究入侵植物的不同地理種群的種類和進化特征的手段多種多樣，除了常規(guī)利用形態(tài)、解剖結(jié)構和生理生化方法外，分子生物學手段也發(fā)揮著重要作用。近年來，DNA條形碼（DNA barcode）技術在植物分類鑒定中的應用越來越廣泛（寧淑萍等，2008；任保青等，2010）。DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段，目前最常用的是ITS、rbcL、trnH-psbA等基因序列。這些序列具有長度高度保守性等特點，可以較好的用來進行生物種群的分類研究（Baldwin，1992；Group，2009；Kress et al.，2007；Wang et al.，2010）。另外一種常用的方法是隨機擴增多態(tài)性DNA標記法（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）（Lynch et al.，2010；Powell et al.，1996）。該方法于上世紀90年代初誕生，是建立在PCR基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的分子技術，現(xiàn)已廣泛的應用于生物的品種鑒定、系譜分析及進化關系的研究上。利用上述分子生物學手段來進行生物遺傳多樣性、生態(tài)型進化等分析是一種可靠快速的方法，尤其對入侵物種的擴散途徑和種群分類進化等方面的研究具有重要的應用意義。

目前對中國北方地區(qū)分布的不同地理種群少花蒺藜草的入侵、擴散和進化等研究報道較少，尤其兩種不同表型的蒺藜草屬植物的種群差異和進化分類學研究尚未見報道。本研究利用ITS、rbcL、trnH-psbA等序列保守和變異的特點對中國北方地區(qū)兩種表型的蒺藜草屬植物進行進化差異分析，并結(jié)合其生物學特性來確定其物種分類學地位。同時采用RAPD技術對來源于中國北方不同地理區(qū)域的少花蒺藜草種群遺傳多樣性進行了分析，初步摸索了少花蒺藜草在北方農(nóng)牧交錯帶干旱半干旱地區(qū)的擴散傳播路徑及種群遺傳多樣性特點，以期為揭示少花蒺藜草入侵機制、防治少花蒺藜草的危害提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

圖1 不同地理種群采樣點分布圖 Fig. 1 Distribution map of sampling points of different geographical populations

在中國北方農(nóng)牧交錯帶地區(qū)選取蒺藜草屬雜草（包括直立型和匍匐型兩種表型）入侵較為嚴重的16個地理種群進行取樣，收集這些樣本的成熟種子及植物葉片。具體地理種群和命名見圖1所示，16個取樣點具體信息為：內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗（AH-A，42°28.935′N，119°20.353′E；AH-B，41°99.307′N，120°07.978′E；AH-C，42°47.007′N，120°52.357′E）、遼寧省朝陽市（CY，41°32.050′N，120°27.301′E）、遼寧省錦州市凌?？h（LH，41°18.541′N，121°27.301′E）、遼寧省錦州市易縣（YX，41°32.878′N，121°14.651′E）、遼寧省阜新市彰武縣（ZW，42°48.454′N，121°58.608′E）、內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)大林鎮(zhèn)（TL-Ⅰ，43°43.691′N，122°41.191′E）通遼市科爾沁左翼后旗金寶屯鎮(zhèn)（TL-Ⅱ，43°22.596′N，123°29.339′E）通遼市科爾沁左翼后旗（TL-Ⅲ，43°00.867′N，122°25.094′E）、內(nèi)蒙古通遼市庫倫旗澳倫新村（TL-Ⅳ，42°48.454′N，121°58.608′E）、內(nèi)蒙古通遼市科爾沁左翼中旗小努 日 木村（TL-Ⅴ，43°96.938′N，123°10.286′E）、內(nèi)蒙古通遼市科爾沁左翼中旗花吐古拉鎮(zhèn)（TL-Ⅵ，43°86.697′N，122°8.384′E）、內(nèi)蒙古通遼市四合 屯 牧場（TL-Ⅶ，43°39.292′N，122°03.710′E）、內(nèi)蒙古通遼市開魯縣大泡子村（TL-Ⅷ，43°31.583′N，121°28.904′E）、內(nèi)蒙古通遼市奈曼旗八仙筒鎮(zhèn)（TL-Ⅸ，43°11.857′N，121°15.469′E）。擴增DNA條形碼保守序列及RAPD分析的材料取自兩種不同表型的植物葉片組織。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

將采集的種子播種于光照培養(yǎng)箱，溫度設定白天30 ℃，夜間20 ℃，光照周期16 h。取出苗后生長14 d的幼苗葉片組織，采用改良CTAB方法提取植物樣本總DNA（Stewart，1993；王濤等，2017）。

利用ND5000超微量紫外分光光度計（Beijing BioTeke Corporation）測定DNA純度和濃度，將DNA提取液稀釋至終濃度30 ng·μL-1待用。

1.2.2 DNA條形碼分析

采用文獻報道的方法分別擴增ITS、rbcL、trnH-psbA基因序列（Baldwin，1992；Group，2009；Kress et al.，2007；Wang et al.，2010）。

ITS擴增通用引物ITS5（上游引物，5′GGAA GTAA AAGT CGTA ACAAGG3′）和ITS4（下游引物，5′TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC3′）。PCR擴增反應體系（25 μL）：10×Buffer（含2 mM Mg2+）12.5 μL，正反引物各1 μL，0.12 mM dNTPs 2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7μL。反應程序如下：預變性95 ℃，5 min；變性94 ℃，1 min；復性54 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min；共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

rbcL引物序列為：1F：ATGTCACCACAAAC AGAAAC，724R：TCGCATGTACCTGCAGTAGC，25 μL反應體系：10×Buffer（含2 mM Mg2+）12.5 μL，正反引物各1 μL，0.12 mM dNTPs 2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序如下：預變性95 ℃，4 min；變性94 ℃，30 s；復性53 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min；共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

trnH-psbA引物序列為：psbA(F)：CTTATGCAT GAACGTAATGCTC，trnH2(R)：CGCGCGCATGGT GATTCACAATCC。25 μL反應體系：10×Buffer（含2 mM Mg2+）12.5 μL，正反引物各1 μL，0.12 mM dNTPs 2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7μL。反應程序如下：預變性95 ℃，4 min；變性94 ℃，30 s；復性53 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min；共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 RAPD分析

RAPD隨機引物購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。利用這些引物進行RAPD擴增，對條帶清晰試驗進行至少3次的重復實驗。

PCR反應體系：總體積為25 μL，包括10×Buffer（含2 mM Mg2+）2.5 μL，0.2 mM引物1 μL，0.12 mM dNTPs 1μL，1 U Taq DNA聚合酶，DNA模板1 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，36 ℃復性45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后，72 ℃延伸5 min。每次PCR反應均設不含模板DNA的空白對照。擴增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理主要參照文獻所述方法（Nei et al.，1979），將RAPD電泳譜帶位點上有擴增位點的記為1，無擴增位點的記為0，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，用Pop Gene 32、NTsys 2.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。主要數(shù)據(jù)指標為：群體的多態(tài)位點百分率P=擴增的多態(tài)位點數(shù)/擴增的總位點數(shù)×100%、Nei’s基因多樣性（He）、Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)（H0）、Nei’s遺傳一致度（I）和遺傳距離（D）的參數(shù)分析；最后用NTsys 2.1軟件進行基于遺傳距離的聚類分析，構建親緣進化遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種不同表型蒺藜草屬植物的分類學鑒定

入侵中國北方地區(qū)的蒺藜草屬植物分布著許多地理生態(tài)群，主要包括兩種表型：直立型和匍匐型。這兩種表型的蒺藜草屬植物外形上存在較大的區(qū)別，直立型相比匍匐型具有較大的葉片、莖直立、株高較高和一級分蘗數(shù)高，但是單株種子量和二級分蘗數(shù)低（圖2）。通過DNA條形碼保守序列差異分析進一步確定這兩種不同表型的植物在分類學上的地位。3種保守序列引物PCR擴增的結(jié)果如圖3顯示，兩種表型的蒺藜草屬植物均得到單一的特異擴增條帶。對擴增的條帶進行測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中相關序列進行比對（圖4）。其中，兩種表型的蒺藜草屬植物的ITS序列比對結(jié)果均與Khan S報道的蒺藜草（C.echinatus）[NCBI登錄號Sequence ID: gb|KF850611.1|]關系最近，序列相似度 均為99%。而兩種蒺藜草屬的保守序列之間相似度也為99%。因此筆者綜合判斷得出，入侵中國北方地區(qū)的兩種表型蒺藜草屬植物均為少花蒺藜草（C.spinifex）。造成兩種表型差異的原因可能與光照、溫度、水分等不同環(huán)境因素的長期影響有關。對于少花蒺藜草的拉丁名，目前也有多種表述。筆者根據(jù)文獻資料，并沿用目前國際上較為通用的說法（Simon，2010；張婷等，2017），建議統(tǒng)一使用C.spinifex作為少花蒺藜草的拉丁名。

圖2 少花蒺藜草的兩種不同表型差異 Fig. 2 Differences between the two phenotypic types of C. spinifex

圖3 兩種表型的蒺藜草屬植物DNA條形碼保守序列擴增電泳圖 Fig. 3 Amplified electrophoresis of DNA barcode conservative sequences of the two phenotypic types

圖4 兩種表型的植物保守序列在NCBI的比對結(jié)果 Fig. 4 Comparison of DNA barcode sequences of the two phenotypic types in NCBI

2.2 入侵中國北方地區(qū)不同地理種群少花蒺藜草的進化關系分析

對200條RAPD隨機引物進行擴增篩選，其中有12條引物能夠擴增出清楚、多態(tài)性明顯的條帶，獲得擴增產(chǎn)物長度為200-2000 bp的條帶37個，其中具有多態(tài)性的有35個。擴增結(jié)果表明不同引物所擴增出的譜帶數(shù)不同，不同材料之間的擴增帶數(shù)存在多態(tài)性。對12條引物的擴增結(jié)果進行統(tǒng)計，結(jié)果見表1，多態(tài)性條帶比率（P）為94.59%，每條引物的多態(tài)性位點在2-4個之間，平均每個引物擴增出3.08個位點。各條帶均有較大的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)及Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)，反應了各個樣點之間存在豐富的多態(tài)性。

采用Nei’s遺傳一致度（I）和遺傳距離（D）對入侵中國北方地區(qū)不同少花蒺藜草種群遺傳進化程度進行分析，結(jié)果見表2。16個地理種群中，樣點TL-Ⅵ與的樣點TL-Ⅷ遺傳一致度最高，遺傳距離最近（I=0.8919，D=0.1144），親緣關系近；而樣點TL-Ⅵ與樣點TL-Ⅲ、樣點AH-A與樣點YX及樣點YX與樣點TL-Ⅱ 3組的遺傳距離遠，親緣關系稍遠。樣點AH-C與其他各樣點遺傳距離均較遠。

表1 12條隨機引物的擴增結(jié)果（5′-3′） Table 1 The amplification results of 12 random primers (5′-3′)

為了進一步確立這16個地理種群的親緣進化關系，基于Nei’s遺傳距離來構建UPGMA聚類圖譜（圖5）。當遺傳相似度閾值為0.6時，可將16個地理種群劃分成5個類，即內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗西部地區(qū)、通遼市奈曼旗、通遼市左翼中旗樣本；通遼市庫倫旗樣本；通遼市科爾沁左翼后旗、遼寧省朝陽市、彰武縣樣本；凌海市、易縣樣本；以及赤峰市敖漢旗北部地區(qū)。當遺傳距離閾值為0.79時，可基本將所有地理種群分開。

表2 種群遺傳一致度和遺傳距離 Table 2 Nei's original measures of genetic identity and genetic distance

圖5 中國北方地區(qū)不同地理種群的少花蒺藜草UPMGA聚類圖 Fig. 5 UPGMA dendrogram for the 16 population based on Nei’s genetic distance

通過上面的分析，我們可以初步判斷出中國北方地區(qū)少花蒺藜草的入侵路線。研究結(jié)果表明，赤峰市敖漢旗所取的3個樣點少花蒺藜草入侵途徑不同。南部地區(qū)（AH-B）少花蒺藜草與遼寧省朝陽市的樣本親緣關系較近（D=0.4754），北部地區(qū)（AH-A）與通遼市奈曼旗的樣本親緣較近（D=0.4329）。遼寧省凌海市與易縣兩地的少花蒺藜草親緣關系較近（D=0.392），而易縣的樣本又與彰武縣的樣本親緣關系較近（D=0.5199），同時，彰武縣與通遼市左翼后旗樣點間的遺傳距離也相對較小，通遼市境內(nèi)的各個取樣點之間的關系也可以根據(jù)遺傳距離明確。因此我們判斷，入侵內(nèi)蒙古、遼寧地區(qū)的少花蒺藜草傳播擴散路徑有兩條主線，一條是凌海-易縣-彰武-通遼市左翼后旗—通遼市左翼中旗，同時彰武地區(qū)的少花蒺藜草又擴散到朝陽市、通遼市左翼后旗地區(qū)擴散到庫倫旗；另一條為通遼市左翼中旗-開魯縣-奈曼旗-赤峰市敖漢旗，同時庫倫旗的少花蒺藜草也向敖漢旗方向擴散。

3 討論

3.1 入侵中國北方地區(qū)的蒺藜草屬植物分類學地位

對于入侵中國北方地區(qū)的少花蒺藜草的分類地位觀點不一，爭論不休。如徐軍等（2011）認為，入侵地的蒺藜草應為光梗蒺藜草（C.incertus）；而安瑞軍（2013）認為，入侵地的少花蒺藜草為一個新種，拉丁名應為C.pauciflorus。兩篇報道皆在總結(jié)前人文獻，僅根據(jù)表型特征得出的推論，這種分類學混亂的局面不利于對少花蒺藜草的入侵機制的研究及防治技術的開發(fā)。因此，本研究根據(jù)入侵中國北方的兩種不同表型植物的形態(tài)學特征，結(jié)合《中國植物志》的描述，初步判斷其均應為蒺藜草屬（Cenchrussp.）植物，又利用更為精確的分子生物學方法，通過對兩種表型的蒺藜草屬植物（直立型和匍匐型）的ITS等保守序列進行擴增測序和比較分析，判定這兩種表型的蒺藜草屬植物均為少花蒺藜草（C.spinifex）。根據(jù)筆者所在團隊多年的調(diào)查研究結(jié)果顯示，匍匐型少花蒺藜草主要在中國北方農(nóng)牧交錯帶干旱半干旱沙地分布，而直立型少花蒺藜草在中國分布范圍較廣，從東北地區(qū)、東部沿海，直到海南島均有分布。這可能與不同環(huán)境條件下表型的變異有關，這也與《中國植物志》中關于兩種表型植物的分布規(guī)律描述一致（中國科學院中國植物志委員會，1990）。

3.2 中國北方地區(qū)少花蒺藜草的地理種群遺傳多樣性及傳播擴散路徑分析

利用RAPD技術能夠有效地對一些物種進行遺傳多樣性分析，這種分子生物學手段從DNA序列變異和進化水平來分析生物種群之間的進化地位差異，所獲得的結(jié)果較為客觀和真實，該方法可廣泛應用于動物、植物和微生物的分類鑒定研究（Jones et al.，2015；Lynch et al.，2010；Powell et al.，1996；Shiue et al.，2015；Stewart et al.，1993）。目前，國內(nèi)已有較多報道利用RAPD技術分析研究不同糧食作物及經(jīng)濟作物的遺傳多樣性（林新春等，2003；肖猛等，2015；徐影等，2013；翟亞輝等，2013），但是對于入侵植物少花蒺藜草的分類及進化地位方面還未見報道。本實驗通過RAPD技術對入侵中國北方地區(qū)的少花蒺藜草不同地理種群進行比對研究，發(fā)現(xiàn)其具有豐富的遺傳多樣性特點。

少花蒺藜草種子可通過農(nóng)具、動物攜帶、水流等方式迅速向外擴散傳播，加上其自身所具有的耐旱、抗寒、耐貧瘠及繁殖能力強等特點，在中國北方地區(qū)形成了不同的地理種群。對這些地理種群的遺傳變異和進化進行研究，可以揭示少花蒺藜草在中國北方地區(qū)的入侵路線，有利于對其入侵、傳播和危害的遏制（張衍雷等，2015；張志新等，2015）。本研究結(jié)果初步描繪了中國北方地區(qū)入侵少花蒺藜草的入侵傳播路線。從傳播路徑圖上可以看出，少花蒺藜草的主要擴散方式是跨區(qū)域車輛運輸活動，如凌海-左翼中旗路線主要是沿G101和G304國道進行，敖漢旗-左翼中旗路線主要沿G111國道進行。所以，加強地區(qū)間的檢疫工作是防止少花蒺藜草擴散蔓延的重要手段。另外一種人為擴散方式是少花蒺藜草種子隨貨物夾雜或隨牧草引種傳播。本研究發(fā)現(xiàn)，凌海市的少花蒺藜草可能是內(nèi)蒙古、遼寧地區(qū)少花蒺藜草傳播的源頭。由于凌海市緊鄰錦州市，不排除少花蒺藜草種子可能是隨進出口貨物或牧草引種而帶入的，隨后向其他各地傳播。然而，本研究并未對錦州地區(qū)及其他周邊地區(qū)的少花蒺藜草進行分析，也未采集國外少花蒺藜草的生物樣本，所以具體推論還仍需進一步試驗驗證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合形態(tài)學特征分析，采用DNA條形碼技術，研究了中國北方農(nóng)牧交錯帶地區(qū)兩種表型的蒺藜草屬雜草的分類學地位，通過保守序列測序和分析比對，確定了兩種不同表型（直立型、匍匐型）植物均為少花蒺藜草（C.spinifex）。采用RAPD技術對來源于不同地理區(qū)域的少花蒺藜草種群遺傳多樣性進行了分析，構建了親緣進化遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)入侵中國東北三省及內(nèi)蒙古地區(qū)的少花蒺藜草沿不同國道方向的傳播主線主要有兩條：一條是凌海-易縣-彰武-通遼市左翼后旗-通遼市左翼中旗，同時彰武地區(qū)的少花蒺藜草又擴散到朝陽市、通遼市左翼后旗地區(qū)擴散到庫倫旗；另一條為通遼市左翼中旗-開魯縣-奈曼旗-赤峰市敖漢旗，同時庫倫旗的少花蒺藜草也向敖漢旗方向擴散。研究結(jié)果為進一步揭示少花蒺藜草入侵的生態(tài)學機制奠定了理論依據(jù)。