頂空氣相色譜法測定頭孢泊肟酯中三乙胺的殘留量

王晨 顧江軍 李東偉 崔晨輝 王晶,* 王彥廣

(1 浙江大學(xué)，杭州 310027；2 浙江華方藥業(yè)股份有限公司，臺(tái)州 318020)

頭孢泊肟酯是第三代口服廣譜頭孢菌素，臨床上主要用于上、下呼吸道感染、泌尿道感染、婦科及外科感染等的治療，具有治療劑量小、給藥次數(shù)少、耐受性好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。在原料藥生產(chǎn)中，合適的溶劑可以提高產(chǎn)率和藥物質(zhì)量，有機(jī)溶劑是藥物合成中必不可少的組分。但是，當(dāng)藥品所含的殘留溶劑水平高于安全值時(shí)，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，因此對(duì)殘留溶劑的控制受到越來越多的關(guān)注[3]。常用的生產(chǎn)頭孢泊肟酯的工藝中主要用到四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、三乙胺等有機(jī)溶劑[4-7]，中國藥典自2010版開始收錄頭孢泊肟酯[8-9]。近年來，也陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道頭孢泊肟酯中的殘留溶劑的檢測方法[10-11]。但是，目前尚未見測定頭孢泊肟酯中三乙胺殘留量的報(bào)道。雖然三乙胺的限度標(biāo)準(zhǔn)在美國藥典和中國藥典的正文均沒有硬性規(guī)定，但均在凡例中要求凡工藝用到的溶劑需檢驗(yàn)。由于三乙胺具有助溶和輕度的防腐作用，因此需要控制其殘留限度[12]。目前三乙胺已收載于人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)，Q3C(R6)中[13]，規(guī)定其限度為5000ppm，歐洲藥品質(zhì)量管理局(EDQM)也規(guī)定其殘留限度為320ppm，因此為控制頭孢泊肟酯的質(zhì)量，本著從嚴(yán)控制的原則，本文計(jì)劃將三乙胺的殘留量控制在320ppm。本文參照中國藥典2015年版通則0861殘留溶劑檢查法，建立了一種簡便靈敏、準(zhǔn)確可靠的檢測三乙胺殘留量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

(1)Aglient 7890B氣相色譜儀，7697A頂空氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器；(2)ME204E電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 樣品及試劑

(1)三乙胺，分析純，臨安青山化工試劑廠，批號(hào)：20140109；(2)二甲基亞砜，分析純，Honeywell，批號(hào)：DN861；(3)供試品：頭孢泊肟酯(CPDP)，浙江華方藥業(yè)股份有限公司提供；批號(hào)：20151201、20151202和20151203。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Elite-5-AMINE(30m×0.32mm, 1.5μm)；檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID)；柱溫：程序升溫，初始柱溫50℃，保持10min，再以20℃/min的速率升至200℃，保持5min；進(jìn)樣口溫度：200℃；檢測器溫度：250℃；載氣：N2；載氣流速：2.0mL/min；進(jìn)樣體積：1.0mL；分流比：5:1；平衡溫度：80℃；平衡時(shí)間：30min；進(jìn)樣閥溫度：90℃；傳輸管溫度：100℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶液的配制

精密移取1.0mol/L NaOH溶液5mL，置于20mL頂空瓶中，再精密移取二甲基亞砜1mL，置于該頂空瓶中，加蓋密封，搖勻，作為空白溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密移取三乙胺63.7mg，用1.0mol/L NaOH溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻，作為對(duì)照品母液；精密移取對(duì)照品母液1mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液5mL，置于20mL頂空瓶中，再精密加入二甲基亞砜1mL，加蓋密封，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的配制

取供試品0.1g，精密稱定，置于20mL頂空瓶中，精密移取1.0mol/L NaOH溶液5mL，使其溶解，再精密移取二甲基亞砜1mL，置該頂空瓶中，加蓋密封，作為供試品溶液。

2.2.4 回收率測試液的配制

精密稱取供試品80.3、101.3和120.4mg，分別置于20mL頂空瓶中，精密移取1.0mol/L NaOH溶液5mL，使其溶解，再精密移取二甲基亞砜1mL，置于頂空瓶中，加蓋密封，分別標(biāo)記為樣品空白1～3溶液。

精密稱取三乙胺50.2mg，用1.0mol/L NaOH溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻；精密移取該溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液1；精密稱取供試品80.4、80.3和80.8mg，分別置于20mL頂空瓶中，精密移取5mL對(duì)照品儲(chǔ)備液1，使其溶解，再精密移取二甲基亞砜1mL，加蓋密封，搖勻，分別標(biāo)記為回收率測試液1～3。

精密稱取三乙胺63.7mg，用1.0mol/L NaOH溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻；精密移取該溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液2；精密稱取供試品100.5、101.3和101.7mg，分別置于20mL頂空瓶中，精密移取5mL對(duì)照品儲(chǔ)備液2，使其溶解，再精密移取二甲基亞砜1mL，加蓋密封，搖勻，分別標(biāo)記為回收率測試液4～6。

精密稱取三乙胺77.8mg，用1.0mol/L NaOH溶液溶解并定容至100mL容量瓶中，搖勻；精密移取該溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液3；精密稱取供試品122.4、121.7和122.5mg，分別置于20mL頂空瓶中，精密移取5mL對(duì)照品儲(chǔ)備液3，使其溶解，再精密移取二甲基亞砜1mL，加蓋密封，搖勻，分別標(biāo)記為回收率測試液7～9。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液連續(xù)頂空進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果三乙胺峰理論塔板數(shù)在28000左右，均大于5000，三乙胺峰與相鄰峰的分離度在35以上，均大于1.5，三乙胺峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.23%，小于10%，符合要求。

2.3.2 專屬性考察

取“2.2”項(xiàng)下空白溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)行頂空氣相色譜分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶液對(duì)測定無干擾；供試品溶液中各組分分離良好，三乙胺未檢出，三乙胺處無干擾，其它組分對(duì)三乙胺測量無干擾，方法專屬性良好，色譜圖見圖1～3。

2.3.3 檢測限和定量限的測定

精密移取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣分析，當(dāng)三乙胺峰的信噪比(S/N)約為3時(shí)，得三乙胺的檢測限為0.0265μg/mL，換算樣品濃度后相當(dāng)于0.0001%，結(jié)果見表1。

精密移取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣分析，記錄三乙胺峰的信噪比(S/N)約為10時(shí)，得三乙胺的定量限為0.0796μg/mL，換算樣品濃度后相當(dāng)于0.0005%，結(jié)果見表2。

2.3.4 線性范圍試驗(yàn)

精密移取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品母液0.1、0.5、0.8、1.0、1.5和2.0mL，置于100mL容量瓶中，加1.0mol/L NaOH溶液至刻度，配制成相當(dāng)于10%、50%、80%、100%、150%和200%對(duì)照品儲(chǔ)備液濃度的溶液，搖勻；精密移取上述各溶液5mL，置于20mL頂空瓶中，再精密加入二甲基亞砜1mL，加蓋密封，搖勻，進(jìn)行頂空氣相色譜分析，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y=92.624X+23.077，r=0.9992(表3和圖4）。

2.3.5 準(zhǔn)確度(回收率)試驗(yàn)

取“2.2.4”項(xiàng)下樣品空白1、2、3溶液，回收率測試液1～9分別進(jìn)行頂空氣相色譜分析，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計(jì)算三乙胺的量，同時(shí)計(jì)算三乙胺的回收率，結(jié)果表明，三乙胺的回收率在95%～105%范圍內(nèi)，平均回收率為100.16%，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.38%，符合要求，結(jié)果見表4。

2.3.6 精密度(重復(fù)性)試驗(yàn)

圖1 空白溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank solvent

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample

圖3 對(duì)照品和供試品混合溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of mixed solution of reference substance and sample

表1 三乙胺檢測限Tab.1 The limit of detection of triethylamine

表3 線性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Linear test result

表2 三乙胺定量限Tab.2 The limit of quantitation of triethylamine

圖4 三乙胺線性回歸曲線Fig.4 Standard curve of triethylamine

按“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液的配制方法配制對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，平行操作6次，結(jié)果三乙胺峰面積的RSD為1.67%(n=6)，表明方法精密度好，結(jié)果見表5。

2.3.7 耐用性考察

在其他條件不變的情況下，分別單獨(dú)改變起始柱溫、流速、色譜柱，考察測試結(jié)果不受影響的程度?？疾炝肆魉俜謩e為1.8、2.0和2.2mL/min，起始柱溫分別為45、50和55℃，同一型號(hào)不同編號(hào)的色譜柱時(shí)，三乙胺峰理論板數(shù)，分離度和峰面積RSD。結(jié)果表明，改變以上單一色譜條件時(shí)，三乙胺峰理論板數(shù)均大于5000，三乙胺峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，峰面積RSD均小于10%，符合要求，方法耐用性良好。

2.3.8 樣品的測定

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中三乙胺的含量，測定結(jié)果為未檢出，結(jié)果見表6。

表5 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.5 Results of precision test

表4 三乙胺回收率數(shù)據(jù)Tab.4 Results of recovery test of triethylamine

表6 樣品檢測結(jié)果Tab.6 Results of sample determination

3 討論

3.1 進(jìn)樣方式的選擇

氣相色譜法有頂空進(jìn)樣和直接進(jìn)樣兩種方式，考慮到三乙胺的沸點(diǎn)較低，適宜采用頂空進(jìn)樣法測定[12,14]，且頂空進(jìn)樣法對(duì)儀器、系統(tǒng)污染小，對(duì)儀器維護(hù)保養(yǎng)更有利，因此選擇頂空進(jìn)樣。

3.2 色譜柱的選擇

先后試驗(yàn)了HP-5毛細(xì)管柱(30m×0.32mm, 0.25μm)和DB-624毛細(xì)管柱(30m×0.53mm, 3μm)，對(duì)空白溶液、對(duì)照品溶液分別頂空進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)三乙胺的理論塔板數(shù)符合要求，但是拖尾因子均大于2.0，分別為4.03455和3.63697，拖尾比較嚴(yán)重，難以準(zhǔn)確積分；采用色譜柱Elite-5-AMINE(30m×0.32mm, 1.5μm)時(shí)，三乙胺峰形明顯改善，三乙胺的理論塔板數(shù)和拖尾因子都符合要求，且甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃和甲苯等溶劑對(duì)三乙胺均無干擾，非常適合測定三乙胺的殘留量。

3.3 溶媒介質(zhì)和計(jì)算方式的選擇

已知三乙胺是有機(jī)堿，可以選擇NaOH溶液作為溶劑[15]，而頭孢泊肟酯在堿性溶液中會(huì)發(fā)生水解，產(chǎn)生頭孢泊肟酸，會(huì)降低NaOH溶液的濃度，影響到三乙胺的峰面積。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增加NaOH的濃度時(shí)，頭孢泊肟酯水解消耗的NaOH對(duì)體系pH影響不大，三乙胺的峰面積影響不大，可以選擇外標(biāo)法計(jì)算三乙胺的含量。因此，選擇1.0mol/L NaOH溶液為溶劑，以外標(biāo)法計(jì)算三乙胺的殘留量。