荔枝狀CaCO3@HA/Fe3O4磁性介孔多級微球的制備

肖文謙, 張靜, 李克江, 鄒新宇, 蔡昱東, 李波, 劉雪, 廖曉玲

荔枝狀CaCO3@HA/Fe3O4磁性介孔多級微球的制備

肖文謙, 張靜, 李克江, 鄒新宇, 蔡昱東, 李波, 劉雪, 廖曉玲

(重慶科技學(xué)院 納微復(fù)合材料與器件重慶市重點實驗室, 重慶 401331)

為了克服常規(guī)的生物陶瓷微球缺乏靶向功能的缺點, 本研究制備了內(nèi)核為CaCO3, 外殼為磁性可調(diào)控羥基磷灰石(HA)的新型荔枝狀多孔微球。結(jié)果表明: 抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)能有效地負(fù)載于磁性HA微球上, 并具備磁性靶向功能。此外, HA外殼具有良好的生物相容性和pH響應(yīng)特性, 可在模擬酸性腫瘤細(xì)胞環(huán)境中控制DOX的釋放, 有效殺死腫瘤細(xì)胞, 并在模擬正常細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中減少對正常細(xì)胞的毒副作用。這種新型的微球材料具有超順磁性能, 且微結(jié)構(gòu)可控, 是一種智能化藥物控釋微球載體, 可以靈敏地釋放DOX, 從而有效地實現(xiàn)抗腫瘤活性。

核殼結(jié)構(gòu); 微球; 羥基磷灰石; DOX

目前, 具有尺寸、形狀和結(jié)構(gòu)可控的功能性微球的制備因其特殊的科學(xué)意義和廣泛的技術(shù)應(yīng)用, 具有重要意義[1-3]。另外, 超順磁性材料因其獨特的磁性特征以及在生物醫(yī)學(xué)中的重要應(yīng)用, 在過去的幾十年中引起了廣泛關(guān)注[4]。尤其是超順磁性納米材料已被廣泛研究用于藥物輸送、生物分離和分子診斷[5-7]。在各種磁性納米材料中, 幾種類型比如Fe3O4和-Fe2O3超順磁性氧化鐵, 由于其在生理條件下良好的生物相容性和穩(wěn)定性, 被認(rèn)為是具有特殊醫(yī)學(xué)用途的理想材料[8]。為了擴(kuò)展其生物醫(yī)學(xué)功能, 將多種藥物如消炎類藥物、抗腫瘤藥物及生長因子等與超順磁性氧化鐵相結(jié)合, 構(gòu)建的藥物載體能夠?qū)崿F(xiàn)長時間的局部藥物輸送。

目前, 通常有兩種方法可用于制備氧化鐵基超順磁性介孔生物材料。一種是制備純氧化鐵介孔/空心微球, 然而其低比表面積和較小的孔體積極大地限制了它們作為功能性多孔材料的應(yīng)用。此外, 純氧化鐵材料在生物系統(tǒng)中易于團(tuán)聚和快速生物降解[9-10]。為了克服這些缺點, 近幾年發(fā)展了另一種基于氧化鐵基質(zhì)的復(fù)合材料, 如將二氧化硅、鈣磷陶瓷和高分子聚合物與氧化鐵相結(jié)合[11-13]。在這些基質(zhì)材料中, 鈣磷陶瓷由于無毒性, 孔徑可調(diào)、高的比表面積和孔體積而被認(rèn)為是與氧化鐵相結(jié)合并拓寬其生物應(yīng)用的理想材料[14]。

羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2, HA)是一種典型的鈣磷陶瓷, 是自然骨的主要無機成分, 多孔HA生物陶瓷已被廣泛用于骨組織工程和藥物輸送領(lǐng)域[15-17]。然而, 傳統(tǒng)HA藥物載體沒有靶向運輸功能, 這影響了它們在局部藥物遞送中的應(yīng)用[18-19]。最近, 通過共沉淀法[20]、模板法[21]、生物礦化涂 層[22]、浸涂法[23]、乳化法[24]、超聲波噴涂熱解法[25]和超聲波混合法[26]等, 研究者們深入研究了將Fe3O4摻入HA從而得到HA/Fe3O4的磁性復(fù)合微球。所獲得的磁性HA微球具有多種功能, 如靶向給藥、磁性運輸和癌癥熱療[18]、新型磁導(dǎo)組織再生[27]、可重復(fù)使用的生物傳感器[28]和磁性可回收/可恢復(fù)的催化劑和吸附劑[29]等。然而, 這些HA/Fe3O4復(fù)合材料大都屬于微觀結(jié)構(gòu)不可控的粉末或塊體材料, 相比于超微結(jié)構(gòu)可控的微球而言, 這限制了它們作為可注射骨再生生物材料和細(xì)胞/藥物負(fù)載等方面的應(yīng)用。而具有核–殼結(jié)構(gòu)的超順磁性HA/Fe3O4微球, 由于其核殼雙相成分, 具有獨特的物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì), 在眾多功能材料中脫穎而出, 具有廣泛的潛在應(yīng)用。純HA具有降解性較慢的缺點, 而純的CaCO3則降解較快, 制備HA與CaCO3的雙相復(fù)合陶瓷則可以綜合二者的優(yōu)點。但是, 精確合成同時具有核–殼分級雙相結(jié)構(gòu)和多功能的超順磁性HA/Fe3O4微球仍然面臨著很大的挑戰(zhàn)。因此, 尋找更加簡便和有效的方法以用于控制超順磁性HA/ Fe3O4微球的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能, 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注。

本研究通過水熱法合成了具有新型荔枝狀結(jié)構(gòu)且超順磁性可調(diào)的HA微球。將Fe3O4微球通過共沉淀的形式摻入CaCO3微球中, 作為反應(yīng)的前驅(qū)體模板, 在Na2HPO4溶液中進(jìn)行水熱反應(yīng), 控制水熱反應(yīng)時間從而成功制備了以CaCO3為內(nèi)核、HA/Fe3O4為外殼的新型荔枝狀超順磁性可控的復(fù)合陶瓷微球, 并評估了它們的藥物裝載能力和pH響應(yīng)特性, 以及體外抗腫瘤細(xì)胞特性等性質(zhì)。

1 實驗方法

1.1 藥品與試劑

阿霉素(DOX)購自阿拉丁試劑公司, 聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)購自麥克林公司, 氯化鈣(99%)、碳酸鈉(98%)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4, 99%)、六水三氯化鐵(FeCl3·6H2O, 99%)、檸檬酸三鈉(99%), 乙酸鈉(99%)、乙二醇(99%)、氫氧化鈉(99%)、鹽酸、乙醇≥99%、磷酸鹽緩沖鹽水(pH=(3.4±0.1)、(5.7±0.1)、(7.4±0.1)), 均購自成都科龍化學(xué)試劑公司, 分析純; 實驗室自制去離子水。

1.2 荔枝狀CaCO3@HA/Fe3O4微球的制備

采用CaCO3/Fe3O4微球作為硬模板, 通過水熱法制得荔枝狀超順磁CaCO3@HA/Fe3O4微球。以六水三氯化鐵為主要原料合成的Fe3O4微球, 參考之前的報道[30], 通過溶劑熱法制備得到的黑色Fe3O4微球。制備步驟如下: 1.35 g六水三氯化鐵和0.05 g檸檬酸三鈉溶解在40 mL乙二醇中, 然后加入3.6 g醋酸鈉再連續(xù)攪拌直到完全溶解。該溶液被轉(zhuǎn)移到50 mL 聚四氟乙烯襯里高壓釜, 密封并保持在200 ℃反應(yīng)15 h, 然后冷卻到室溫。所得的黑色沉淀采用磁鐵收集, 使用去離子水和無水乙醇分別清洗3次, 然后用真空干燥箱在60 ℃下6 h處理得到Fe3O4微球。

在磁力攪拌條件下, 將10 mL 0.2 mol/L的CaCl2溶液滴入100 mL 2 mg/mL的PSS, 得到混合溶液。同時配制四組相同的溶液, 依次加入CaCO3理論生成含量為0、25wt%、33wt%、50wt%的Fe3O4微球, 超聲處理約30 min。依次向溶液中逐滴加入10 mL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液, 迅速攪拌。離心收集沉淀(5000 r/min, 5 min), 分別用去離子水和無水乙醇洗滌三次, 得到CaCO3/Fe3O4微球沉淀, 60 ℃真空干燥24 h, 保存在離心管中備用。

將約100 mg干燥后的CaCO3/Fe3O4前驅(qū)體模板加入到50 mL 0.1 mol/L的磷酸氫二鈉溶液中, 用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合溶液的pH至11.0, 精確控制在120 ℃條件下水熱反應(yīng)1 h, 隨后離心收集, 使用無水乙醇和去離子水各洗滌三次, 取其沉淀物, 在-80 ℃下預(yù)凍12 h, 經(jīng)預(yù)凍后將其放在-60 ℃冷凍干燥機中干燥24 h, 即制備得到不同結(jié)構(gòu)的荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球。所制備的CaCO3@HA/Fe3O4微球其Fe3O4理論含量為0、25wt%、33wt%、50wt%, 分別記為S0、S1、S2和S3。

1.3 表征

利用場發(fā)射掃描電鏡(FSEM, JSM-7800, 日本電子)在5 kV的加速電壓和工作距離約10 mm的條件下觀察微球的微觀結(jié)構(gòu), 使用Image-Pro Plus 6.0計算SEM圖像上的微球尺寸分布, 同時利用EDS考察微球核殼化學(xué)成分組成。利用X射線衍射儀(XRD, smartLab-9, 日本理學(xué))考察樣品的相組成, 2掃描范圍: 20°~80°, 掃描速率為2 (°)/min。采用氮氣等溫吸附測定微球的比表面積與微孔分布(Quan-tachrome, USA)。通過綜合物性測量系統(tǒng)(Phy-sical Property Measurement System, PPMS)在300 K下表征樣品的磁性。

1.4 微球的DOX吸附與釋放實驗

選取DOX作為體外藥物吸附和釋放性能實驗的模型藥物, 吸附DOX的荔枝狀CaCO3@HA/ Fe3O4微球在不同pH的PBS緩沖液中進(jìn)行藥物釋放。首先, 將100 mg微球加入到10 mL 1 mg/mL的DOX水溶液中, 在37 ℃的恒溫?fù)u床中以120 r/min的速度吸附48 h。而后離心收集, 去離子水沖洗, 除去游離的DOX, 最終得到負(fù)載DOX的荔枝狀CaCO3@HA/Fe3O4微球, 將所得載有DOX的微球置于37 ℃的恒溫箱中干燥24 h。

然后根據(jù)以下步驟分別在pH為3.4、5.7和7.4的PBS緩沖溶液中作藥物釋放實驗: 將10 mg載DOX的微球置于含有30 mL不同pH溶液的45 mL離心管中。分別在1、4、7、12、24、36、48 h, 及3、5、7、10、14 d時定時取樣1 mL, 冷凍保存, 隨后向溶液中再加等體積(1 mL) pH相同的PBS溶液, 并振蕩均勻, 繼續(xù)在37 ℃的恒溫箱中進(jìn)行釋放, 以此類推。最終將取得的所有樣品用酶標(biāo)儀(Mu-ltiscan Go 1510, Thermo Fisher Scientific)在477 nm處測量吸光度, 并用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度, 每個條件測3個平行樣取平均值, 并通過計算獲得微球的累積藥物釋放量。

1.5 體外細(xì)胞毒性測定

體外細(xì)胞毒性實驗采用荔枝狀CaCO3@HA微球和Fe3O4理論含量為25wt%的荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球作為測試材料, 分別在負(fù)載DOX和不負(fù)載DOX的情況下, 選取HaCaT (人正常皮膚永生化角質(zhì)細(xì)胞, 代表正常細(xì)胞)和HN6(口腔鱗癌細(xì)胞, 代表癌細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗。將兩種細(xì)胞以3×103/孔接種在96孔板中, 加入100 μL 10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基, 在37 ℃、5vol%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換液后向96孔板中加入100 μL 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基, 培養(yǎng)基內(nèi)含有濃度分別為0、1、10、50、100 μg/mL微球材料, 繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。通過CCK-8增殖試驗測量細(xì)胞活性, 隨后使用酶標(biāo)儀(Multiscan Go 1510, Thermo Fisher Scientific, USA)在450 nm處讀取96孔板的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面形貌

圖1顯示了不同F(xiàn)e3O4含量的微球(S0-S3)的SEM照片?？梢娝苽涞膶φ战M不含F(xiàn)e3O4的陶瓷微球和摻雜不同含量Fe3O4的陶瓷微球的結(jié)構(gòu)相似, 且微球粒徑約為4 μm。從高倍照片(圖1(a2, b2, c2, d2))中, 很明顯地觀察到經(jīng)水熱處理之后的微球形狀與水果荔枝相似, 呈典型的核殼雙層結(jié)構(gòu), 其外表面均勻分布著長短均一的針狀納米晶體, 可以推測這些針狀晶體應(yīng)該是CaCO3溶解后再在其表面沉積的羥基磷灰石晶體。隨著Fe3O4摻雜含量的增加, 微球表面越來越多地生成應(yīng)該屬于Fe3O4微球的顆粒狀物質(zhì)。并可發(fā)現(xiàn), 微球的形態(tài)結(jié)構(gòu)并不受Fe3O4的影響, 且微球體的大小均一、分散性較好、具有豐富的孔結(jié)構(gòu)。

圖1 不同F(xiàn)e3O4含量的超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球的SEM照片

圖2顯示了Fe3O4為25wt%的陶瓷微球經(jīng)水熱轉(zhuǎn)化前后的TEM照片?？梢姺磻?yīng)前后的晶體微結(jié)構(gòu)有較大的差異, 特別是反應(yīng)后出現(xiàn)了明顯的針狀晶體, 進(jìn)一步印證了SEM結(jié)果的推測, 其表面針狀晶體應(yīng)該是HA。表面形貌觀察證實, 以CaCO3/Fe3O4微球作為硬模板前驅(qū)體通過簡單的水熱處理, 成功地制備了具有核-殼結(jié)構(gòu)的荔枝狀微球。

觀察圖3的EDS圖像, 顯然荔枝狀超順磁性微球的內(nèi)核和外殼成分有較大差別, 微球的外殼上的Fe元素含量明顯多于內(nèi)核, 且外殼的成分多屬于羥基磷灰石的Ca、P成分, 這也進(jìn)一步證明經(jīng)水熱處理的Fe3O4/CaCO3微球轉(zhuǎn)化成CaCO3@HA/Fe3O4。

圖2 Fe3O4為25wt%的CaCO3@HA/Fe3O4微球水熱轉(zhuǎn)化前(a)后(b)的TEM照片

2.2 荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球的相組成

圖4顯示了不同F(xiàn)e3O4摻雜含量的CaCO3微球經(jīng)水熱處理后所制備的荔枝狀超順磁性CaCO3@ HA/Fe3O4微球(S0-S3)的XRD圖譜。對照標(biāo)準(zhǔn)的HA卡片, 空白組S0的主要衍射峰與HA的標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS#09-0432)完全重合, 圖中對照組樣品S0主要是HA相, 而S1~S3也出現(xiàn)HA特征峰, 說明四組微球樣品皆存在HA相。經(jīng)比較圖4發(fā)現(xiàn), S0組在2=29.5°左右有一組明顯的方解石特征峰, 說明水熱處理之后的HA微球中還含有方解石型碳酸鈣并未完全轉(zhuǎn)化。而S1~S3并未出現(xiàn)這一組特征峰, 說明Fe3O4的摻入促進(jìn)了方解石的轉(zhuǎn)化。據(jù)圖4箭頭所顯示的結(jié)果可知, S1~S3三組譜線在2=35.71°為Fe3O4的特征峰, 對應(yīng)的是Fe3O4的(311)晶面, 據(jù)此可證明荔枝狀超順磁性微球是HA相和Fe3O4相的復(fù)合物。隨著Fe3O4含量的增加, HA峰強度明顯下降, 而Fe3O4特征峰半高寬更加彌散, 表明摻入磁性Fe3O4組分降低了HA的結(jié)晶度。與SEM照片 (圖1)相比, 微球內(nèi)核還有一種XRD無法檢測出的相成分。結(jié)合微球殼層斷面的高倍SEM照片, 內(nèi)部的成分為球形結(jié)構(gòu), 與HA的針狀結(jié)構(gòu)差別較大, 推測無定形CaCO3可能還保留在微球模板內(nèi)部, 無定形CaCO3沒有典型的XRD特征峰, 其可能在合成CaCO3/Fe3O4微球的初始階段就已經(jīng)存在。除此之外, XRD結(jié)果還顯示, 觀察到產(chǎn)物的2沒有明顯移動, 而離子摻雜到HA的結(jié)構(gòu)中會導(dǎo)致XRD的2發(fā)生明顯變化[23], 這表明Fe3O4并未進(jìn)入HA的晶格, 而是與HA晶體共存。

圖3 摻雜25wt% Fe3O4的CaCO3@HA/Fe3O4微球水熱轉(zhuǎn)化后的EDS圖像

圖4 不同F(xiàn)e3O4含量荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球的XRD圖譜

2.3 孔結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會規(guī)定, 和不同含量Fe3O4摻雜的陶瓷微球樣品的氮氣等溫吸附–脫附曲線圖(圖5(a))和BJH孔徑分布曲線(圖5(b))來看, 前者氮氣等溫吸附–脫附曲線可以被認(rèn)定為由具有狹縫狀孔隙的顆粒聚集體衍生的H3型回線。其在相對壓力0.8~1.0區(qū)間急劇上升, 說明具有典型的介孔結(jié)構(gòu), 進(jìn)一步由吸附–解吸附等溫線和密度泛函理論(BJH)孔徑分布曲線證實(圖5(b))均具有小于15 nm的介孔結(jié)構(gòu)。用N2等溫吸附曲線計算得知, 25wt% Fe3O4組分的CaCO3@HA/Fe3O4微球的比表面積高達(dá)196.481 m2×g–1, 孔容為0.576 cm3×g–1。33wt%和50wt% Fe3O4組分的微球比表面積分別為50.749和46.623 m2×g–1, 通過對比三組樣品的結(jié)果可知, 隨著Fe3O4摻雜量的增加, 比表積有降低的趨勢。可能是由于Fe3O4微球比表面積較小, 較多的Fe3O4的摻入使得微球表面的比表面積減少。從BET結(jié)果分析可以推測, 該微球的藥物吸附能力很高, 為該超順磁性微球在藥物控釋載體等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.4 形成機理

圖6顯示了荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球形成的可能機理。根據(jù)之前的文獻(xiàn)報道[31]可以推測: PSS在水溶液中電離, 其親水性的磺酸根帶負(fù)電, 容易吸附帶正電的Ca2+, 形成大量的PSS-Ca的復(fù)合物, 隨著CO32–的加入, 成為CaCO3晶體的成核位點。隨著CaCO3晶體的生長, PSS-Ca會吸附在成核位點上, 誘發(fā)二次成核。隨著Fe3O4微球加入, Fe3O4微球可能也會與磺酸根結(jié)合, 或者進(jìn)入長鏈的間隙, 并在PSS調(diào)控下生長成摻雜有Fe3O4微球的CaCO3微球。在水熱反應(yīng)的高溫高壓環(huán)境里, 生成的CaCO3微球開始溶解并釋放Ca2+, 并在熱力學(xué)驅(qū)動下, CO32–與PO43–發(fā)生離子交換, 在CaCO3微球表面逐漸生長出棒狀HA晶體, 而Fe3O4微球保留在原來的位置, 處于殼層結(jié)構(gòu)中。控制水熱反應(yīng)的時間, 最終得到荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球。

圖5 不同F(xiàn)e3O4摻雜含量的磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球的等溫吸附曲線(a)和孔徑結(jié)構(gòu)分布圖(b)

圖6 荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球形成機理示意圖

2.5 磁性能測試

磁性HA微球可以均勻地分散于水溶液中, 隨著磁含量的增加其顏色逐漸加深(圖7(a))。當(dāng)磁體靠近時, 微球可以被快速吸引, 幾乎所有的微球都被吸引到了磁鐵一側(cè), 分離產(chǎn)生清澈的水溶液。由 圖 7(b)所示的曲線可知, 所制備的磁性微球具有明顯的超順磁特征, 且隨著四氧化三鐵含量的增加飽和磁化強度(Ms)明顯隨之增加。所制備的磁性HA產(chǎn)物S1、S2和S3的飽和磁化強度分別為10.45、11.50、24.69 emu/g (emu/g=4π×10–7Wb·m/kg) (圖7(b))。通過與純Fe3O4微球(飽和磁化強度為65 emu/g)對比, 可以大致計算出復(fù)合微球中Fe3O4的理論含量分別是: 16.08wt%、17.69wt%和37.98wt%[32]。飽和磁化強度隨著Fe3O4摻雜含量增加而顯著增加, 表明這些荔枝狀超順磁性CaCO3@ HA/Fe3O4微球的磁性可以通過調(diào)控Fe3O4的量來調(diào)節(jié), 可賦予微球良好的磁性靶向功能。

圖7 (a)荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球懸浮液受磁鐵吸引的數(shù)碼照片, 及(b)300 K 下不同F(xiàn)e3O4含量的CaCO3@HA/Fe3O4微球的磁滯回線

2.6 DOX藥物吸附釋放

荔枝狀超順磁性HA微球顯示出較高的載藥量, 三種微球的載藥量超過95 mg/g, 載藥率也高于95% (表1), 與先前報道的陶瓷微球載體[33]相比, 相對較高。

圖8顯示了25wt%的Fe3O4含量的CaCO3@HA/ Fe3O4微球在不同pH的PBS中的DOX體外累計釋放結(jié)果。DOX在各個pH的PBS中均呈現(xiàn)出兩個明顯的釋放階段, 在第一個48 h內(nèi)相對快速釋放, 其中, 在pH=3.4時, 釋放率達(dá)到了98%。與之相對的是, 在pH=5.4和7.4均具有明顯的控釋行為, 在隨后的時間一直到336 h (14 d)內(nèi)持續(xù)釋放, 并在14 d時DOX累積釋放分別約為80%和65%。

從荔枝狀磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球的釋放DOX曲線顯示藥物釋放極大地依賴于浸泡介質(zhì)的pH。隨著pH的降低, 藥物的累計釋放量明顯增加。最初的快速釋放可歸因于物理吸附藥物分子的快速擴(kuò)散, 其與外表面或通道的入口附近相互作用更弱。然后, 存儲在通道中并吸附在內(nèi)表面的藥物在較長時間的介質(zhì)中浸泡滲透后將溶解并沿著水性通道擴(kuò)散到介質(zhì)中。同時, DOX的緩釋行為可能是由于藥物分子與材料表面氫鍵之間的強烈相互作用。進(jìn)一步的分析表明, 微球在低pH條件下容易釋放高濃度的DOX。這可能是由于在酸性環(huán)境中發(fā)生的磷酸鈣陶瓷微球的降解。該結(jié)果表明, 荔枝狀超順磁性HA微球可用于靶向治療, 利用其pH敏感性, 可針對腫瘤和炎癥環(huán)境作靶向治療。

將上述實驗結(jié)果總結(jié)如表1所示?？梢奡1~S3的藥物裝載量和裝載率接近。

圖8 37 ℃下載藥CaCO3@HA/Fe3O4微球在不同pH (3.4、5.7、7.4)的PBS中的DOX累計釋放曲線

表1 不同F(xiàn)e3O4含量的CaCO3@HA/Fe3O4微球的比表面積(SBET)、載藥量(DLA)和藥物裝載率(DLE)

2.7 體外生物相容性試驗和抗腫瘤細(xì)胞試驗

圖9顯示CCK8試驗法測定HaCaT和HN6細(xì)胞在有無DOX負(fù)載的CaCO3@HA/Fe3O4微球和CaCO3@HA微球下的存活率。在微球沒有負(fù)載DOX的情況下, 隨著微球濃度的增加, 與CaCO3@ HA/Fe3O4微球和CaCO3@HA微球共培養(yǎng)的HaCaT和HN6細(xì)胞存活率沒有明顯變化(所有活力均高于90%), 并有些微升高, 充分說明載體材料具有良好的生物相容性。

由圖9(a)可知, 正常HaCaT細(xì)胞分別與載DOX的CaCO3@HA/Fe3O4微球和載DOX的CaCO3@HA微球一起孵育時, 隨著微球濃度的逐漸增加, 細(xì)胞的活性有所下降, 所有細(xì)胞的存活率都在75%以上。而由圖9(b)可知, 吸附DOX藥物的微球?qū)N6細(xì)胞的抑制作用明顯強于HaCaT細(xì)胞。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), 隨著藥物濃度的增加, 腫瘤細(xì)胞HN6的存活率急劇下降, 尤其在100 μg/mL濃度下存活率可低至30%。這可能是腫瘤細(xì)胞HN6形成的酸性微環(huán)境有利于載DOX的微球材料釋放出更多的藥物, 抑制了腫瘤細(xì)胞的生長, 而正常細(xì)胞的中性微環(huán)境中只有較少的藥物釋放出來。不難看出, 無論是CaCO3@ HA/Fe3O4微球還是CaCO3@HA微球, 均有一定的pH敏感特性, 而具有超順磁性能的CaCO3@HA/ Fe3O4微球pH敏感特性更強, 更有利于腫瘤細(xì)胞的靶向治療。

圖9 CCK8試驗法測定正常細(xì)胞HaCaT(a)和腫瘤細(xì)胞HN6(b)在載DOX和不載DOX的CaCO3@HA/Fe3O4和CaCO3@HA微球下的24 h存活率柱狀圖

3 結(jié)論

本研究采用簡單的水熱法制備荔枝狀超順磁性CaCO3@HA/Fe3O4微球, 并用于靶向藥物控釋系統(tǒng), 結(jié)果表明介孔微球能夠有效負(fù)載抗腫瘤藥物DOX, 載藥量高達(dá)95 mg/g。其摻雜的Fe3O4微球賦予了生物陶瓷微球有效的磁性靶向功能, 并且其飽和磁化強度可以通過摻入Fe3O4微球含量進(jìn)行控制。由于CaCO3@HA/Fe3O4微球顯著的pH響應(yīng)特性, 其在腫瘤所處的酸性環(huán)境中能釋放更多的DOX。基于本研究結(jié)果可見, CaCO3@HA/Fe3O4微球是一種具備超順磁性能的腫瘤靶向治療的潛在藥物載體。

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Litchi-like Superparamagnetic Hydroxyapatite Microspheres with Hierarchically Mesoporous Microspheres

XIAO Wen-Qian, ZHANG Jing, LI Ke-Jiang, ZOU Xin-Yu, CAI Yu-Dong, LI Bo, LIU Xue, LIAO Xiao-Ling

(Chongqing Key Laboratory of Nano/Micro Composite Materials and Devices, Chongqing University of Science and Technology, Chongqing 401331, China)

Due to the fact that the conventional bioceramic microspheres lack target function, novel litchi-like porous microspheres composed of a core of CaCO3and a tunable magnetic-hydroxyapatite (HA) shell were successfully prepared in this study. Antitumor drug, doxorubicin (DOX), was effectively loaded on the HA microspheres which possess magnetic targeting function. In addition, the HA shell, which had favorable biocompatibility and pH response characteristics, could be used to control release of loaded DOX from the litchi-like superparamagnetic microspheres in a simulated acidic tumor cell environment, effectively killing tumor cells and reducing toxic side effects to normal cells. The smart design presented in this study, which incorporates a tunable superparamagnetic shell and a controlled architecture, allows the sensitive release of drugs for efficient antitumor activity.

core-shell; microspheres; hydroxyapatite; DOX

TQ174

A

1000-324X(2019)09-0925-08

10.15541/jim20180497

2018-10-18;

2018-12-24

國家自然科學(xué)基金(11532004, 51603026); 重慶市高校創(chuàng)新團(tuán)隊項目(CXTDX201601032); 重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究項目(CSTC 2016jcyjA0541, CSTC 2018jcyjAX0711, CSTC2015JCYJBX0003); 重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目(KJ1601301)

National Natural Science Foundation of China (11532004, 51603026); Chongqing University Innovation Team Project(CXTDX201601032); Chongqing Research Program of Basic Research and Frontier Technology (CSTC 2016jcyjA0541, CSTC2018jcyjAX0711, CSTC2015JCYJBX0003); Chongqing Municipal Education Commission Science and Technology Research Project (KJ1601301)

肖文謙(1982-), 男, 博士, 講師. E-mail: wqxiao@cqust.edu.cn

李波, 教授. E-mail: Libo@cqust.edu.cn; 劉雪, 講師. E-mail: Liuxue@cqust.edu.cn