聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理及應(yīng)用

馮帥博

摘? 要：該文主要圍繞聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的原理和應(yīng)用進(jìn)行敘述，其中對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的內(nèi)涵、原理、特點(diǎn)等進(jìn)行了詳細(xì)分析，然后對該技術(shù)的主要應(yīng)用內(nèi)容展開了詳細(xì)剖析。該文旨在提升聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的應(yīng)用水平，不斷加深相關(guān)人員對其的理解和認(rèn)知，在這個過程中不斷激勵相關(guān)人員展開研究，推動其被廣泛應(yīng)用于人們生產(chǎn)和生活的各個方面。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);技術(shù)原理;DNA

中圖分類號：Q555? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 前言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是近幾年被研究員發(fā)現(xiàn)的一種新型的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，它主要屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，但是隨著相關(guān)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們對生產(chǎn)和生活有了更高的要求，不斷推動新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，目前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究工作中，對于其進(jìn)步和發(fā)展有重要意義。

1 關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的內(nèi)涵

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為一種分子生物學(xué)技術(shù)，可以完成DNA片段的擴(kuò)增工作，它最突出優(yōu)勢就是可以脫離生物，在生物體外開展DNA的復(fù)制工作，并且可以將少數(shù)、微量的DNA進(jìn)行很大程度地擴(kuò)增，對于很多鑒定和研究工作都有著重要意義，只要相關(guān)人員從古生物體中提取出一點(diǎn)DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)就可以實(shí)現(xiàn)鑒定工作。

1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的技術(shù)原理

DNA的半保留復(fù)制工作有利于傳代和生物進(jìn)化，而在反應(yīng)過程中雙鏈性質(zhì)的DNA可以在一定條件下完成向單鏈的轉(zhuǎn)變，通常情況下，其在高溫的情況下也可以發(fā)生變化，但是高溫同樣會使DNA聚合酶喪失活性，而為了避免成本不斷上升，相關(guān)人員在之后的反應(yīng)中一直采用的是耐高溫性質(zhì)的DNA聚合酶。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中的循環(huán)參數(shù)有很多，其中為了控制預(yù)變性，相關(guān)人員需要對加熱的時間進(jìn)行嚴(yán)格控制，保證DNA模板完全發(fā)生變形和DNA聚合酶完全被激活;變性步驟以及引物退火等工作都是需要相關(guān)人員不斷提高注意力，并且相關(guān)人員還應(yīng)當(dāng)注意引物延伸、循環(huán)數(shù)和最后延伸方面的反應(yīng)。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的主要步驟

一個標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程主要包括3個步驟，其中DNA變性是整個反應(yīng)的內(nèi)容，主要實(shí)現(xiàn)雙鏈DNA向單鏈的轉(zhuǎn)變，第一個步驟就是退火，在系統(tǒng)溫度逐漸降低的時候會形成一個局部的雙鏈，延伸是第二個步驟，在DNA聚合酶的活性達(dá)到最佳的時候和模板形成互補(bǔ)，最后一個步驟就是檢測工作。

1.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題

假陰性、陰性和假陽性是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的常見問題，假陰性問題出現(xiàn)的主要表現(xiàn)就是沒有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，相關(guān)人員需要從反應(yīng)過程的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手，開展合理分析，而陰性問題出現(xiàn)的主要原因可能是Taq酶的缺失，出現(xiàn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)內(nèi)部的擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致就是假陽性的問題。

1.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的實(shí)驗(yàn)污染問題

雖然聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具有靈敏度高以及特異反應(yīng)強(qiáng)的優(yōu)勢，但是十分容易污染，通常情況下，在使用該技術(shù)的過程中會由于各種原因產(chǎn)生污染，相關(guān)人員需要對污染進(jìn)行檢測，然后不斷避免和減輕污染狀況。

2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的主要特點(diǎn)

2.1 較強(qiáng)的特異性

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具有較強(qiáng)的特異性，同時這種特異性是受到4種因素的影響，如果模板DNA和引物正確結(jié)合，同時遵循了堿基配對原則，并且保證了聚合酶反應(yīng)的忠實(shí)性，就可以完全發(fā)揮其自身的特異性和保守性。另外，相關(guān)人員選擇了特異性和保守性較高的靶基因區(qū)，那么就可以不斷提升其特異能力。

2.2 較高的靈敏性

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在實(shí)際產(chǎn)生增量的過程中，其主要的擴(kuò)大方式是指數(shù)的形式，如果起始待測模板在一開始處于皮克量級，那么在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用之后就可以達(dá)到微克量級，在產(chǎn)生增量的工作中具有較強(qiáng)的靈敏度。除此之外，在鑒定工作中也具有十分強(qiáng)大的靈敏性。

2.3 簡便與快速

在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的工作中，聚合酶主要是采用具有耐高溫性質(zhì)的Taq DNA聚合酶，它要求工作人員一次性可以完成反應(yīng)液的添加工作，隨即就可以在DNA擴(kuò)增儀上開展一系列的反應(yīng)，象變性、退火以及延伸等。其擴(kuò)增反應(yīng)完成時間在正常情況下是2 h～4 h，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析時，相關(guān)人員通常會采用電泳，具有無放射性污染以及便于推廣的優(yōu)勢，不一定要使用同位素。

2.4 較低的純度要求

傳統(tǒng)的反應(yīng)工作一般需要相關(guān)人員對細(xì)胞等進(jìn)行嚴(yán)格地篩選工作，然后再開展一系列復(fù)雜的步驟，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)就不需要對細(xì)菌、病毒、微生物等進(jìn)行分離或者培養(yǎng)。在擴(kuò)增模板的選擇上要求并不嚴(yán)格，一些粗制的DNA模板也可以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)工作，或者在實(shí)際應(yīng)用過程中由于效率等多種因素，也可以直接使用體腔液、血液等，純度要求較低。

3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)原理的主要應(yīng)用

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

在臨床醫(yī)學(xué)的研究和應(yīng)用進(jìn)程中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)主要可以被應(yīng)用在2個方面，一方面，該技術(shù)可以對基因進(jìn)行分析，對于遺傳病的發(fā)現(xiàn)、確診以及診治等都有重要作用，它主要是推動了遺傳病的診斷工作從表面轉(zhuǎn)化為基因方面，提升了準(zhǔn)確性和效率。另一方面，腫瘤作為一種疾病嚴(yán)重威脅人們的身體健康，而在醫(yī)學(xué)上對其的診斷和轉(zhuǎn)移的確定都可以應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，該技術(shù)可以對細(xì)胞的基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后展開詳細(xì)地分析和檢查，就可以確定腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在目的基因制備中的應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)主要能夠讓DNA不再依附于染色體結(jié)構(gòu)，就是指即便沒有活的生物作為載體，該技術(shù)也可以通過恰當(dāng)?shù)囊镌谏矬w之外的環(huán)境下進(jìn)行基因擴(kuò)增，不需要建立噬菌體等事物，對于整個基因制備工作起了很大的簡化作用，象篩選、克隆等步驟都可以被省略。在該工程中應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)能夠直接通過逆轉(zhuǎn)錄步驟，然后就可以實(shí)現(xiàn)cDNA文庫的構(gòu)建。

3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用

在生態(tài)學(xué)的研究過程中，相關(guān)研究人員需要對一些細(xì)菌、微生物等進(jìn)行鑒別和鑒定，而一些傳統(tǒng)的鑒定方法由于需要經(jīng)歷一個長期的病菌培養(yǎng)過程，難以滿足生態(tài)學(xué)研究對于效率的需要，為此，相關(guān)人員可以將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)用在生態(tài)學(xué)研究內(nèi)的病菌鑒定工作中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)主要將微生物作為材料，直接對其類型進(jìn)行鑒定，另外，在一些被保護(hù)動物的身體部位確定工作中，也可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)。

3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在擴(kuò)增DNA方面的應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。熱循環(huán)是PCR過程重要組成部分，每個循環(huán)包括變性（90 ℃～93 ℃、退火（50 ℃～55 ℃）和延伸（71 ℃～73 ℃）3個恒溫過程，能夠?qū)⒛繕?biāo)DNA的數(shù)目在一個循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增近一倍，經(jīng)過30個循環(huán)可使目標(biāo)DNA擴(kuò)增到數(shù)億倍，從而實(shí)現(xiàn)核酸分子的富集，便于進(jìn)一步分析和實(shí)驗(yàn)。為此，該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。目前，PCR儀多采用傳統(tǒng)的熱循環(huán)方式，這種方式升降溫變化速率較慢，導(dǎo)致反應(yīng)時間長，30個循環(huán)通常約50 min以上;反應(yīng)體系試劑耗量大，試劑成本較高。為此，基于微加工技術(shù)的PCR微流控芯片因其體積小，反應(yīng)快而成為研究的熱點(diǎn)。

4 結(jié)語

綜上所述，該文對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)原理和應(yīng)用情況進(jìn)行論述，通過分析和研究發(fā)現(xiàn)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在臨床醫(yī)學(xué)、基因制備、生態(tài)學(xué)研究、擴(kuò)增DNA等方面都發(fā)揮了重要作用，相關(guān)研究人員應(yīng)該加強(qiáng)對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的重視程度，希望可以不斷推動技術(shù)的發(fā)展使其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。

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