枸杞總黃酮提取工藝優(yōu)化及不同年份枸杞總黃酮含量測定

劉元林，龍 鳴，田曉靜，張福梅，陳士恩，馬忠仁，，NuruI Izza Nordin

(1．西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.Industrial Biotechnology Research Centre，SIRIM Berhad，1 Persiaran Dato' Menteri，Section2，40700 Shah Alam，Selangor，Malaysia)

全球約有80多種枸杞屬植物[1]，而我國枸杞主要分布于寧夏、甘肅、青海、新疆、山西、河北、陜西和內(nèi)蒙古等地區(qū)，其中寧夏枸杞2009年被列入《2010版中華人民共和國藥典》，是惟一被列為可以用作藥品的枸杞品種[2].枸杞含有豐富的類胡蘿卜素、多糖及黃酮類等一些生理活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、造血功能作用[3].黃酮是枸杞的主要有效組分之一，有較為廣泛的生理活性作用且有藥用保健功能[4-5].隨著黃酮類化合物研究開發(fā)，枸杞中黃酮類化合物的研究逐步得到關(guān)注.目前枸杞總黃酮提取方法主要有有機(jī)溶劑提取法、超聲波輔助酶提取法、微波輔助酶法、微波法、酶解法等.檢測方法有分光光度法、色譜法、極譜法、薄層色譜法等[6-7].對枸杞總黃酮的研究有一定成果，如枸杞總黃酮不同提取方法比較[8-9]、枸杞總黃酮提取工藝的優(yōu)化[10-12]、枸杞不同部分黃酮研究[13]、枸杞黃酮的分離純化[14-15].在貯藏過程中，枸杞內(nèi)部成分會隨存儲時(shí)間延長而改變[16]，以致枸杞的藥用效果降低.當(dāng)今市場上銷售的枸杞質(zhì)量魚龍混雜，導(dǎo)致市售枸杞質(zhì)量參差不齊，使消費(fèi)者的正當(dāng)合法利益受到侵害.

現(xiàn)有研究主要針對枸杞總黃酮提取方法的優(yōu)化，而在儲存時(shí)間對枸杞總黃酮影響方面的研究較少.本文以乙醇提取法進(jìn)行提取，采用單因素實(shí)驗(yàn)研究浸提溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間四個(gè)因素對總黃酮提取的影響規(guī)律，再采用四因素三水平正交試驗(yàn)乙醇提取工藝.在此基礎(chǔ)上，研究枸杞總黃酮含量隨儲存年份變化情況及結(jié)合物理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，為快速鑒別枸杞的優(yōu)劣、有效監(jiān)測枸杞總黃酮類化合物含量的變化規(guī)律及保護(hù)消費(fèi)者健康提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化樣品購于淘寶、不同生產(chǎn)年份枸杞樣品(2016、2015、2014年及4年以上老陳果)均購自寧夏中寧枸杞市場.對樣品購回后，置于-4 ℃冷凍待用.樣品具體信息見表1.

DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；722E型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；AB-S型電子分析天平(梅特勒—托利多公司)；SXT-06型索氏提取器(上海宏紀(jì)儀器設(shè)備有限公司)；DG120型中藥材粉碎機(jī)(浙江瑞安市春海藥材器械廠)；色差計(jì)(青島帝中計(jì)量儀器有限公司).

無水乙醇、石油醚、乙醚、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純，產(chǎn)自煙臺市雙雙化工有限公司；蘆丁標(biāo)品，分析純，SR8250，購自北京索萊寶科技有限公司.

表1 樣品信息表

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

剔除枸杞中不完整粒與雜質(zhì)后，置于55 ℃烘箱干燥至恒重.干燥完成后取出并于中草藥粉碎機(jī)中粉碎，迅速以密封袋密封，置于-4 ℃冷藏待用.

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

乙醇提取法受到浸提溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間等因素的影響.本研究以枸杞總黃酮提取率為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究浸提溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)，料液比( 1∶5 g/mL、1∶10 g/mL、1∶15 g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL)，提取時(shí)間(1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h)對提取率的影響規(guī)律.

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì).正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2.

1.2.4 枸杞黃酮提取率的測定

參照劉景煜[17]等人所用方法，采用分光光度計(jì)法測定枸杞總黃酮含量，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣含量(C)mg/mL為橫坐標(biāo)，吸光值(A)為縱坐標(biāo)，用最小二乘法求得回歸方程，得到方程為：C=3.9435A+0.008；相關(guān)系數(shù)為R2=0.9940，在0.01～0.110 mg/mL區(qū)間有較好的線性相關(guān)性.

準(zhǔn)確稱取約1.0 g干燥的枸杞粉末，用適量乙醚和石油醚混合物進(jìn)行脫脂4 h，脫脂后進(jìn)行總黃酮提取，用相同體積分?jǐn)?shù)有機(jī)溶劑溶液反復(fù)沖洗.使用有機(jī)溶劑溶液定容到100 mL，作為樣品液備用.用移液管精確移取樣品液5.0 mL置于帶刻度的具塞比色管中，測定波長為510 nm處樣液吸光值.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測液中總黃酮的濃度，代入公式計(jì)算總黃酮的提取率，公式如下：

(1)

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算的樣品比色液中的蘆丁濃度(mg/mL)；

V為比色試液體積(mL)；

d為稀釋倍數(shù)；

m為樣品的質(zhì)量(g).

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 物理參數(shù)檢測

參照GB/T18672[18]和SN/T 0878[19]標(biāo)準(zhǔn)，采用稱量方法測定百粒重；結(jié)合稱量與計(jì)數(shù)測量粒度；使用游標(biāo)卡尺測量枸杞子的長軸長和短軸長;采用色差計(jì)測量a*、b*、L*.每個(gè)參數(shù)重復(fù)檢測三次，取其平均值進(jìn)行后續(xù)分析.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用主成分分析(Principle component analysis，PCA)對不同生產(chǎn)年份進(jìn)行定性判別.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.0軟件(美國SAS軟件公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖由Origin 8.0軟件(美國OriginLab公司)繪制.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸提溫度與總黃酮提取率的關(guān)系

在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶15 g/mL、提取時(shí)間2.5 h、提取2 次的條件下，研究浸提溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80℃、90 ℃)對枸杞總黃酮提取率的影響.結(jié)果見圖1(A)，隨浸提溫度升高提取效果顯著增加.當(dāng)達(dá)到80 ℃時(shí)溫度繼續(xù)提升，提取效果開始下降，70 ℃與80 ℃的提取率相差特別小，故70 ℃、80 ℃為較佳浸提溫度.

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)與總黃酮提取率的關(guān)系

在浸提溫度為70 ℃，料液比為1∶15 g/mL、提取時(shí)間為2.5 h、提取2 次的條件下，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)對枸杞總黃酮提取率的影響.結(jié)果見圖1(B)，枸杞總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而上升.當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過80%，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而降低，因此，乙醇提取枸杞黃酮的較佳濃度為80%.

2.1.3 料液比與總黃酮提取率的關(guān)系

在浸提溫度為70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、提取時(shí)間2.5 h，提取2 次的條件下，研究料液比( 1∶5 g/mL、1∶10 g/mL、1∶15 g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL)對枸杞總黃酮提取率的影響.結(jié)果見圖1(C).就料液比而言，在1∶5～1∶15 g/mL隨乙醇有機(jī)溶劑使用量的增加，提取率也隨著增加，但超過1∶15 g/mL后效果下降.因此，提取枸杞黃酮較佳料液比為1∶20 g/mL.

2.1.4 提取時(shí)間與總黃酮提取率的關(guān)系

在浸提溫度為70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、料液比為1∶15 g/mL、提取2 次的條件下，研究提取時(shí)間(1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h)對枸杞總黃酮提取率的影響.就提取時(shí)間而言，在1 h～2.5 h 內(nèi)，總黃酮提取效果和時(shí)間成正相關(guān)關(guān)系，時(shí)間增加黃酮提取率也隨之增加.在2.5 h時(shí)達(dá)到峰值.此后即使時(shí)間增長，提取率也還在下降，故較佳提取時(shí)間為2.5 h.

圖1 單因素對枸杞總黃酮提取率的影響(A：浸提溫度;B：乙醇體積分?jǐn)?shù);C：料液比;D：提取時(shí)間)

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以浸提溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間為因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，其設(shè)計(jì)表及結(jié)果見表3.

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果表

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2.極差分析的結(jié)果表明，影響順序依次為A>D>C>B，即浸提溫度對黃酮提取效率產(chǎn)生主要作用，其次是提取時(shí)間、料液比及乙醇體積分?jǐn)?shù).較佳提取參數(shù)為A2B2C2D2，即浸提溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶15 g/mL、提取時(shí)間為2.5 h.結(jié)果與孔令明[12]和韓榮生[13]等人得出的結(jié)論相近.驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在該條件下提取率平均值為1.95%±0.013，浸提提取最佳工藝穩(wěn)定有效.

2.3 不同年份枸杞總黃酮提取率及物理指標(biāo)含量測定

在上述正交試驗(yàn)最佳工藝(浸提溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶15 g/mL、提取時(shí)間2.5 h)條件下，提取五個(gè)不同年份寧夏枸杞總黃酮(P<0.05)，結(jié)果見圖2.由圖2可知，2016年的兩種樣品間不存在顯著性差異；2016年的所有樣品和其他年份的樣品有顯著性差異.2015年寧夏樣品和其他年份的樣品有顯著性差異.2014年樣品和其他年份樣品有顯著性差異；4年以上老陳果和其他樣品間存在顯著性差異.這與楊麗[16]等人和王曉宇[20]得出的結(jié)論一致.隨存儲時(shí)間加長、枸杞內(nèi)部的蘆丁含量下降，并可根據(jù)其內(nèi)部黃酮提取率來判斷枸杞的新鮮程度.

圖2 不同年份枸杞總黃酮提取率

2.4 多元統(tǒng)計(jì)分析

以色度、長軸長、短軸長、粒度、百粒重、年份和黃酮提取率等參數(shù)為輸入，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行主成分分析，以前兩個(gè)主成分得分繪圖，實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)綜合分析，并將多維信息降低至兩維，直觀反映不同貯藏年份枸杞的差異，PCA結(jié)果見圖3.

圖3 不同年份寧夏枸杞品質(zhì)主成分分析結(jié)果

如圖3所示，以理化指標(biāo)作為變量時(shí)，第1主成分占全部的54.09%，第2主成分占全部的18.55%，總貢獻(xiàn)率達(dá)到72.64 %，代表了原始數(shù)據(jù)大部分信息，不同組樣品彼此區(qū)分，且組內(nèi)聚集，能實(shí)現(xiàn)五個(gè)年份枸杞的區(qū)分.2015NG樣品因原料為寧夏2015年枸杞果，樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)位于圖中右上角，與其他組樣品有明顯區(qū)分.顏色較高的4NYG和2014NG樣品分布在圖中左半部分，且色澤沿著PC2增大方向而加深.此部分為存儲時(shí)間較長的樣品.顏色較淺的三組樣品(2016NG-1、2016NG-2和2015NG)位于圖中右半部分，此部分樣品的存儲時(shí)間較短.

3 結(jié)論

單因素實(shí)驗(yàn)和四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化乙醇提取枸杞總黃酮工藝，確定較佳的提取條件為A2B2C2D2，即浸提溫度70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶15 g/mL、提取時(shí)間為2.5 h、提取2次.在此優(yōu)化條件下，確定不同生產(chǎn)年份枸杞黃酮含量差異，發(fā)現(xiàn)不同年份的枸杞黃酮含量差異顯著，存儲時(shí)間越短，其內(nèi)部黃酮損耗越小.通過主成分分析，能將五個(gè)年份枸杞子區(qū)分開，這為枸杞新陳的定量判定提供理論依據(jù)，對枸杞的開發(fā)利用和相關(guān)監(jiān)督部門執(zhí)法提供科學(xué)依據(jù).