蛋白質組學在綿羊育種中的應用

齊驁穹，曾 莎，王燕新，廖圓圓，蔡 勇，楊具田

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

細胞是一種通過大量不同性質的相互協(xié)調機制完成自我復制和適應外界環(huán)境改變等過程的個體，是生物體結構與功能的基本單位[1]，理解細胞功能和細胞間信息交流是現(xiàn)代生物學的基本目標.DNA包含必要的遺傳信息，形成一個具有結構性或功能性的有機大分子.中心法則描述了一個信息流，從DNA到RNA再到蛋白質.然而近年來的研究成果使得這一法則遭遇到了挑戰(zhàn)[2].表觀遺傳、剪接、非編碼RNAs(包括microRNAs，miRNAs和lncRNA)、蛋白質與蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)和翻譯后修飾(Post-translational modification，PTM)等都說明了基因型對表型的影響并不是惟一的.蛋白質作為細胞內(nèi)關鍵的功能實體，表達了細胞功能的主要信息，故對蛋白質進行全面的分析也是理解細胞功能和細胞間交流的重要途徑，這種研究方法被稱為蛋白質組學[3].

1 蛋白質組學

蛋白質組是指一個基因組或一類細胞表達的蛋白質總和[4].目前暫時定義為特定時空存在于細胞、組織、器官和有機體內(nèi)的全套蛋白質[5].隨著蛋白質組的提出，產(chǎn)生了蛋白質組學，以蛋白質作為研究對象，檢測細胞、組織或有機體內(nèi)全部蛋白質的組成、蛋白質的表達水平以及蛋白質修飾，以了解PPI以及蛋白質動態(tài)變化規(guī)律的學科[6].

蛋白質組學作為后基因組時代的重要探究方法之一，受到了研究學者的關注.然而，蛋白質組水平上收集數(shù)據(jù)的難度遠遠大于基因組水平和轉錄組水平上的數(shù)據(jù)收集.氨基酸作為組成蛋白質的基本結構具有高度不同的理化性質[7].此外，蛋白質通過不同的剪接、多樣化修飾和復雜的降解所形成的巨大網(wǎng)絡體系，使蛋白質的功能信號在這個高度發(fā)散的網(wǎng)絡體系中被進一步放大.

通常，蛋白質組學研究的第一步是從細胞、組織或體液中提取蛋白質，并根據(jù)研究目的對樣品進行預分離(例如離子交換色譜法)，然后用液質聯(lián)用(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)對這些組分進行分離并進行分析.其中根據(jù)選擇的肽段長度不同，通過串聯(lián)質譜進行分段，再使用數(shù)據(jù)庫搜索引擎進行輸入，以確定相應的肽序列，最后分配的肽序列組裝成蛋白質，對所獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計.通過搜索與隨機數(shù)據(jù)庫估算假陽性鑒定率推斷肽序列，從得到的MS譜圖直接檢測蛋白質數(shù)據(jù)庫的可用性.蛋白質組學的研究步驟比較復雜，主要依靠三部分技術，分別為蛋白質分離技術、蛋白質鑒定技術及蛋白質信息查詢技術[8].蛋白質分離作為蛋白質組學研究的核心，多采用雙向凝膠電泳技術(2D-PAGE)[9]，其原理是根據(jù)蛋白質的等電點和相對分子質量對蛋白進行分離，這樣就能很好地溶解大量蛋白質并進行定量分析.分析發(fā)現(xiàn)其具有高通量、重復性好、敏感度高等優(yōu)點[10，11].而對于氨基酸組分分析，由Edman在20世紀50年代所創(chuàng)立的Edman降解法，可以檢測氨基酸N段序列，以檢測蛋白質的一級結構.盡管Edman降解法測序能獲取較為精確的肽序列，但其試驗成本偏高，且測序速度偏慢.而另一種氨基酸組成分析法是根據(jù)差異蛋白質所具備的特定氨基酸和空間構造來鑒定蛋白質序列.雖然成本較為低廉，但靈敏度不高，且需要大量蛋白質或多肽樣品，在微量分析中會遇到極大限制，并且存在部分酸水解不徹底或某些氨基酸結構出現(xiàn)缺失等缺點[12].為了更好地探究，質譜技術在蛋白質組學研究的過程中被普及.蛋白質大分子先經(jīng)過離子轉化設備轉變?yōu)闅鈶B(tài)離子，接著在分析儀器中依據(jù)離子的質荷比進行分離.分離后的離子順次進入檢測器，進而取得不同質荷比的譜線，即為質譜技術[13].目前，常用的質譜分析儀為基質輔助激光解析離子化質譜和電噴霧離子化質譜[14].蛋白質組學的研究還需要和生物信息學相結合.目前應用于蛋白質組學研究的數(shù)據(jù)庫有蛋白質信息資源PIR、蛋白質序列數(shù)據(jù)庫SWISS-PROT、蛋白質家族和結構域數(shù)據(jù)庫PROSITE、蛋白質序列指紋圖譜數(shù)據(jù)庫PRINTS、蛋白質三維結構數(shù)據(jù)庫PDB、蛋白質二級結構數(shù)據(jù)庫DSSP以及氨基酸索引數(shù)據(jù)庫(amino acid index)等.此外，現(xiàn)在還開發(fā)了多種iTRAQTM數(shù)據(jù)庫用于搜索和分析生物信息元件，其中MASCOT是目前應用最為廣泛的搜索引擎軟件[15-16].

近年來，蛋白質組學技術，特別是以質譜為基礎的蛋白質鑒定，通過儀器的更新?lián)Q代，樣品制備和計算分析技術的累積而日臻成熟，不僅體現(xiàn)在基礎理論的研究，也進一步擴展到應用研究領域當中[17].

2 蛋白質組學在綿羊育種研究中的應用

2.1 研究背景

全世界擁有不同生產(chǎn)性能的綿羊近600個品種，是一個豐富的基因儲藏庫，從短尾型綿羊、細長尾型到肥尾型，從細毛羊、半細毛羊到無絨毛羊，從專用品種到三種品質兼而有之的新型品種，都擁有豐富的品種.大量的綿羊品種因為生產(chǎn)性能和基因特點的各不相同，不僅保證了養(yǎng)羊業(yè)產(chǎn)品的多樣性，還為育種工作提供了無盡的可能性，以達到改良現(xiàn)有品種的生產(chǎn)性能，培育多種優(yōu)良生產(chǎn)性能集于一身的新品種和具有新品質的新品種.因此通過各種新興技術為綿羊育種工作提供新思路、新方法已經(jīng)成為畜牧業(yè)工作者和現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)的重要課題[18].

2.2 綿羊育種方向

目前，綿羊育種研究主要包括羊肉品質的提升、絨毛羊的產(chǎn)絨量和絨毛品質的提升、公母羊生產(chǎn)力的提升以及一些羊副產(chǎn)品品質的提升.

肉用羊肉品質的改變主要分為兩個方面：脂肪沉積和肌肉發(fā)育.通過調控肌肉的生長發(fā)育和肌內(nèi)脂肪、肌間脂肪、內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪的沉積，從而提升產(chǎn)肉量和改善羊肉品質.絨毛用羊則主要圍繞絨和毛的產(chǎn)量和品質進行選育，通過對毛囊細胞和組織的研究，從而改善絨和毛的生長情況，進一步獲得符合生產(chǎn)需要的性能.繁殖力的提升主要圍繞提高公羊精子質量和母羊受胎率進行研究.

2.3 蛋白質組學在綿羊育種的應用

利用目前較為成熟的蛋白質組學技術，可以對綿羊育種在蛋白質水平上進行一系列新的研究.Bouley等[19]采用2-DE技術和質譜技術完成了羊的半腿肌蛋白質表達譜的構建，檢測到500多個可重復的蛋白質位點，然后又使用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜的方法鑒定了其中的129個蛋白質位點.這些蛋白質中，大部分涉及到代謝、細胞結構、細胞免疫，并且肌鈣蛋白存在多種異構體，這可能導致屠宰后的肌肉代謝和肉品質發(fā)生改變.M.Hamelin[20]等用2-DE的方法對特塞爾綿羊肌肉肥大的遺傳性狀進行研究，發(fā)現(xiàn)在肌肉肥大型個體中，與糖酵解相關的蛋白質表達量上調，轉鐵蛋白的表達量增加，而α-抗胰蛋白酶的表達量降低.這可能是兩種蛋白的相互作用，導致了肌肉肥大性狀的產(chǎn)生.Ana M等[21]研究了季節(jié)性減重對綿羊的影響，以便篩選出對季節(jié)性減重有較強抵抗力的品種.試驗選取三種澳洲本土綿羊，一共鑒定出668種蛋白質，其中95種是差異調節(jié)蛋白.篩選出三種季節(jié)性減重抗性相關蛋白質，對綿羊肉制品生產(chǎn)工程做出巨大貢獻.Promeyrat等[22]發(fā)現(xiàn)了鐵蛋白和抗氧化性相關蛋白潛在，標記著蛋白質氧化的過程，并且簡述了白蛋白、氧化還原蛋白、膜聯(lián)蛋白、脂類轉運蛋白和有氧呼吸酶的作用，這項研究以蛋白質氧化為重點，清楚地表明，在機體老化過程中，需要結合幾種標記物來評估肉類對氧化的敏感性.Vincenzo Cunsolo等[23]通過比較研究發(fā)現(xiàn)，羊奶比牛奶更具有潛在過敏性.通過SDS-PAGE和LC-MS技術對羊奶中的乳脂蛋白進行了研究，鑒定出718種與牛奶不同的蛋白質成分，其中644種是綿羊所獨有的基因，其中193種蛋白質是以前從未發(fā)現(xiàn)過的，包括具有健康促進效益的異質組分.MitraArianmanesh等[24]以單側妊娠母羊為研究對象，比較妊娠母羊不同階段子宮角功能蛋白的特異性表達差異.研究發(fā)現(xiàn)了EPCR蛋白質，包括AHCY和HSP60表達量上調，表明這些蛋白質的上調是為了提供更適宜妊娠母羊的子宮環(huán)境.WeiboRen等[25]以過度放牧和適當放牧的綿羊為試驗對象，對其肝臟沉積脂肪進行試驗，試驗用同位素標記的相對定量和絕對定量(iTRAQ)方法分析羊的肝組織蛋白質表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)41種蛋白質在兩個群體中的表達出現(xiàn)差異，大部分差異表達的蛋白質參與蛋白質代謝、轉錄和翻譯調節(jié)與免疫應答等過程.

脂尾型綿羊與生俱來的尾部富集脂肪，逐漸不符合產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)需要，所以在育種工作中對其進行趨向瘦尾化的改良已成為一種必然的趨勢.韓吉龍等[26]選取了五種尾型綿羊，并對尾部脂肪所檢測到的蛋白質進行了差異表達分析.實驗先對尾脂的總蛋白進行了鑒定，通過Label-free，發(fā)現(xiàn)脂肪細胞分化及脂肪酸合成相關的蛋白質在脂尾型綿羊中高表達.同樣高表達的還有參與脂肪代謝和解脂相關的蛋白質.通過蛋白質表達定位發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4和ERK2在尾脂中的表達量較高.前者參與前體脂肪細胞分化過程和脂肪酸的轉運功能，而后者可能與幼齡個體中早期脂肪組織中前體脂肪細胞增殖和分化相關聯(lián).這表明，以FABP4、ERK2為主的蛋白質對于脂尾型綿羊早期尾部脂肪的發(fā)育具有重要影響.同時他們還對早期尾脂中所鑒定到的蛋白質進行了磷酸化蛋白質檢測，鑒定出了分布在804個具有磷酸化修飾蛋白質上的1493個磷酸化位點.其中435個磷酸化差異表達蛋白參與細胞骨架的合成、PTM過程的正調控、蛋白質分解代謝調控、翻譯起始和細胞凋亡通路調控等15個生物學進程，顯示出不同脂尾型綿羊的早期尾部脂肪發(fā)育與磷酸化修飾差異存在一定的相關性，其中以ERK1和ERK2為主的蛋白類激酶經(jīng)過序列分析，發(fā)現(xiàn)可能調節(jié)早期尾部脂肪中相關蛋白質的磷酸化修飾，并對尾脂中前體脂肪細胞增殖分化有正向調控作用.

蛋白質組學對綿羊育種行業(yè)起到了重大作用，它的出現(xiàn)大大推動了分子育種的發(fā)展.蛋白質組學不僅可以在蛋白質水平上對綿羊的各種生產(chǎn)性能進行創(chuàng)新型的研究，還能對前人在綿羊基因組和轉錄組得到的結果進行一系列的驗證，以保證研究的準確性.所以蛋白質組學的出現(xiàn)對于綿羊育種來說具有革命性的意義.

3 展望

蛋白質組學作為21世紀生命科學的重要技術和主要研究方向[27]，其技術已經(jīng)被廣泛地應用于與生命科學相關的各個領域，也為生命科學及其相關學科帶來了新的研究方法和理念[28].隨著蛋白質組學研究的深入，與蛋白質組學技術相結合的畜牧行業(yè)前景更加寬廣，它將是人們深入研究改良羊肉品質、選育優(yōu)良品種、提高繁殖性能和通過飼料加速生長的新途徑，也為廣大畜牧業(yè)工作者指明了新的道路.