兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)背景數(shù)據(jù)的建立

崇立明，楊 陽，王忠輝，姜 娟，賈玉玲，周 莉，孫祖越

（1.上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥理毒理學(xué)研究室，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測(cè)中心，上海200032；2.國家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032；3.復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院，上海200032）

藥物生殖毒性試驗(yàn)研究是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，是藥物進(jìn)入臨床研究及上市的重要環(huán)節(jié)。其中胚胎-胎仔發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)（即Ⅱ段生殖毒性試驗(yàn)）是新藥非臨床安全性評(píng)價(jià)中評(píng)價(jià)外源性因素是否具有致畸作用的標(biāo)準(zhǔn)方法，多年來很多國家和機(jī)構(gòu)，如人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（International Council for Harmonization，ICH）、美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）等都采用或推薦這一方法，是評(píng)價(jià)新藥生殖毒性時(shí)的首選方法。

根據(jù)我國CFDA和ICH（S5）的指導(dǎo)原則［1-2］，胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究中，除了嚙齒類動(dòng)物推薦用大鼠外，一般還需要采用第2 種哺乳動(dòng)物。由于已積累了豐富的家兔背景資料，且容易獲得和使用，因此家兔為優(yōu)先選用的非嚙齒類動(dòng)物。為此，本文總結(jié)了本研究室2011-2018年所完成的10余項(xiàng)兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)，對(duì)溶媒對(duì)照組共計(jì)149只孕兔和1097 只胎仔的數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和統(tǒng)計(jì)分析，初步建立了本研究室兔胚胎-胎仔發(fā)育指標(biāo)的背景資料，該資料對(duì)研究室間方法可靠性比對(duì)，以及研究結(jié)果的解釋均非常重要，同時(shí)也為生殖毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)的開展和結(jié)果判斷提供重要數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

新西蘭兔，3～5 月齡，普通級(jí)，主要購自上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司和上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0007 和SCXK（滬）2012-0011。新西蘭兔飼養(yǎng)在上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所（中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測(cè)中心）普通級(jí)小動(dòng)物房，室溫16～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12～14 h，黑暗10～12 h；新西蘭兔單只飼養(yǎng)于不銹鋼籠內(nèi)，自由飲水、攝食，實(shí)驗(yàn)開始前動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)至少7 d。

1.2 儀器

DS-671電子天平和MS4002TSDR/00電子天平（Mettler Toledo，瑞士）；Motic 體式顯微鏡（日本Olympus Corporation）。

1.3 孕兔妊娠和胎仔生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)檢測(cè)

動(dòng)物交配：挑選發(fā)情雌兔放入雄兔籠內(nèi)，為保證交配成功，根據(jù)情況每次可以雌∶雄=1∶2 比例交配，交配間隔時(shí)間在2～3 h，或采取同一雄兔交配時(shí)間隔約15～16 h交配第2次，如有必要，實(shí)施人工助配。雌兔交配完畢后移出雄兔籠。

孕兔：①體質(zhì)量：妊娠第0 天（gestation day，GD0），GD3，GD6，GD10，GD13，GD15，GD18，GD20，GD24和GD28測(cè)定體質(zhì)量并記錄；②剖宮檢查：GD28安樂死母兔，檢查黃體數(shù)、胎重（連子宮）、胎盤重、胎盤外觀、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)和死胎數(shù)。

胎仔：①性別、胎重、頂臀長(zhǎng)和尾長(zhǎng)；②外觀檢查：對(duì)每只胎仔先經(jīng)肉眼檢查，如肉眼不能確定某種畸形時(shí)，將胎仔放在解剖顯微鏡下進(jìn)一步確定；有無腦積水、露腦、腦疝、腦膜膨出、無眼、小眼、無耳和腭裂；有無多趾、并趾、少趾、無趾、足內(nèi)翻和短趾；有無臍疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂和脊柱側(cè)突；有無短尾、卷尾、無尾和尾分叉；有無肛門閉鎖；③骨骼檢查：頭顱是否完整，骨化程度；有無胸骨節(jié)缺失、骨化不全、雙骨化點(diǎn)、胸骨節(jié)錯(cuò)位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波狀肋；有無四肢骨化不全、粗短、畸形、多趾和少趾等；④內(nèi)臟器官檢查：有無腭裂、舌異常、鼻道擴(kuò)大、單鼻道、腦水腫、腎積水；眼球是否正常；心、肝、脾、肺、腎和子宮等臟器大小和位置是否異常［3-4］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算±s，確定最小值、最大值、95%可信區(qū)間（CI）和變異系數(shù)（CV）。CV=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值×100%。

2 結(jié)果

2.1 孕兔妊娠期體質(zhì)量變化

對(duì)母體體質(zhì)量的影響是評(píng)價(jià)母體毒性的指標(biāo)之一。在兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)中，于GD6～GD18給予受試物，測(cè)得孕兔妊娠各時(shí)期的體質(zhì)量數(shù)據(jù)見表1。孕兔GD0體質(zhì)量為（3.0±0.3）kg，GD28為（3.5±0.4）kg，妊娠期各個(gè)時(shí)間點(diǎn)變異系數(shù)較低，體質(zhì)量增加穩(wěn)定（表1）。

Tab.1 Body mass of pregnant rabbits of different gestation days（GD）

2.2 孕兔生殖功能和胎仔生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)

在胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)中，黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎數(shù)和死胎數(shù)等指標(biāo)通常是衡量胚胎早期和晚期發(fā)育毒性的指標(biāo)，胎仔重、胎盤重、頂臀長(zhǎng)和尾長(zhǎng)同樣也是評(píng)價(jià)受試物對(duì)胎仔是否產(chǎn)生毒性的指標(biāo)，母體毒性有時(shí)會(huì)繼發(fā)的胚胎毒性，胚胎發(fā)育遲緩和（或）遲滯，從而造成胎仔的體質(zhì)量偏低，身體短小。GD28處死孕兔后，取出胎仔，測(cè)定胎仔重和胎盤重，測(cè)量其頂臀長(zhǎng)和尾長(zhǎng)，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)見表2 和表3。研究（表2）可見，174 只雌兔交配成功，有效妊娠數(shù)為149 只，妊娠率為85.6%；剖檢結(jié)果顯示，1140 例著床成功，其中活胎1097 例，吸收胎22例，死胎21例；由于個(gè)別孕兔妊娠的胎仔數(shù)較少，導(dǎo)致平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)、平均活胎數(shù)和胎重（連子宮）的變異系數(shù)較高，這屬于正常的生理現(xiàn)象。表3 的胎仔發(fā)育指標(biāo)中，胎仔體質(zhì)量為（33.4±5.0）g，胎盤重為（4.0±0.8）g，變異系數(shù)偏高，同樣是由于個(gè)別孕兔妊娠的胎仔數(shù)少，導(dǎo)致宮內(nèi)的胎仔發(fā)育較好，胎盤較大；頂臀長(zhǎng)和尾長(zhǎng)變異系數(shù)較低，表明胎仔的發(fā)育比較穩(wěn)定。

2.3 胎仔外觀、內(nèi)臟和骨骼檢查指標(biāo)

對(duì)胎仔的外觀、內(nèi)臟和骨骼進(jìn)行檢查，可進(jìn)一步判斷受試物是否對(duì)胎仔產(chǎn)生毒性。對(duì)每只胎仔先經(jīng)肉眼檢查，如肉眼不能確定某種畸形時(shí)，將胎仔放在解剖顯微鏡下進(jìn)一步確定；100%胎仔進(jìn)行軟組織和骨骼檢查，采用顯微解剖技術(shù)結(jié)合固定法進(jìn)行軟組織檢查；胎仔的骨骼發(fā)育存在變異，包括脊椎骨、胸骨和肋骨的數(shù)量、胸骨節(jié)骨化模式或胸骨節(jié)與肋骨的融合、尾椎的融合等，骨骼的發(fā)育也存在廣泛的可塑性，一般情況下，自然發(fā)生率相對(duì)高的群體所發(fā)生的變異趨勢(shì)經(jīng)常是可逆的，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生很小的或不產(chǎn)生有害性后果［5］。

從本研究室的研究結(jié)果（表4）中見，有2 只胎仔出現(xiàn)外觀異常，分別為露腦（1 例）和卷尾（1 例）；胎仔的內(nèi)臟檢出1 例腦膜膨出；胎仔的骨骼檢查主要表現(xiàn)為胸骨數(shù)目減少〔第5或（和）6胸骨缺失〕和骨化不全，肋骨和尾椎變異表現(xiàn)為數(shù)目不同。

Tab.2 Reproductive index of pregnant rabbits at the endpoint of the experiment

Tab.3 Growth and development index of fetuses on cesarean section day

Tab.4 Examination result of fetal appearance，skeleton and viscera check

3 討論

胚胎-胎仔發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)是妊娠動(dòng)物自胚胎著床至硬腭閉合期間接觸受試物，評(píng)價(jià)受試物對(duì)妊娠動(dòng)物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括胚胎和胎仔的死亡、生長(zhǎng)改變和結(jié)構(gòu)變化等。主要目的在于為母體孕期接觸新藥可能對(duì)胎兒造成的影響提供非臨床的試驗(yàn)依據(jù)。而且，由于新藥臨床試驗(yàn)一般均不包括孕婦，胚胎-胎仔發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果往往是絕大多數(shù)新藥生殖毒性評(píng)價(jià)的唯一數(shù)據(jù)來源。

藥物生殖毒性的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于判斷藥物是否產(chǎn)生致畸作用有重要意義，這項(xiàng)結(jié)果判斷，與正常動(dòng)物妊娠和胎仔發(fā)育等生理指標(biāo)的背景數(shù)據(jù)關(guān)系密切。大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)的背景數(shù)據(jù)曾有少量報(bào)道［6-8］，但是關(guān)于新西蘭兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)的背景數(shù)據(jù)尚未見報(bào)道。

背景數(shù)據(jù)實(shí)際上就是“參考值”，醫(yī)學(xué)參考值是指“正?！比梭w和動(dòng)物的各種生理常數(shù)、體液和排泄物中各種成分含量及人體對(duì)各種刺激變化的反應(yīng)值，其可信區(qū)間被定為95%的參考范圍?？梢詤^(qū)分“正?！迸c“異?！眰€(gè)體，為臨床診斷提供參考。

兔胚胎-胎仔發(fā)育毒性的主要判斷標(biāo)準(zhǔn)之一是孕兔妊娠和胎仔發(fā)育等指標(biāo)（如孕兔體質(zhì)量、攝食量、黃體數(shù)、胎重、胎盤重、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)和著床數(shù)；胎仔性別、胎仔重、頂臀長(zhǎng)和尾長(zhǎng)等）的變化，而對(duì)這些指標(biāo)的分析、評(píng)價(jià)需要以實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的正常參考值，即背景數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系、個(gè)體差異、來源、實(shí)驗(yàn)室條件和測(cè)定方法等影響因素，文獻(xiàn)中的背景數(shù)據(jù)差異也較大。因此，建立自身實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎-胎仔發(fā)育毒性背景數(shù)據(jù)可以為藥物生殖毒性非臨床安全性評(píng)價(jià)提供準(zhǔn)確、可靠、科學(xué)的參考依據(jù)。

本文各指標(biāo)為本研究室近幾年來不同生殖毒性研究數(shù)據(jù)的積累，這些背景數(shù)據(jù)可以為受試物的生殖毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)的可靠性提供非常重要的數(shù)據(jù)支撐。本文僅選擇溶媒對(duì)照組動(dòng)物的數(shù)據(jù)，動(dòng)物也是來自同一地區(qū)，隨著研究的開展，后續(xù)還會(huì)有補(bǔ)充更多的背景數(shù)據(jù)，進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究匯總。另一方面，“正?！迸c“異?！敝笜?biāo)之間也存在交叉，出現(xiàn)“假陰性”和“假陽性”。因此，需收集不同的環(huán)境條件、不同生理、病理情況下的數(shù)據(jù)背景資料，經(jīng)過綜合分析，按不同目的將“正常”與“異?！狈诸悾唧w問題具體對(duì)待，結(jié)合動(dòng)物的整體毒性反應(yīng)，統(tǒng)一分析，使得對(duì)研究結(jié)果的評(píng)價(jià)更加科學(xué)、合理并切合實(shí)際。