豬嵴病毒的特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，姚春陽，王 艷，李 峰，沈志強(qiáng)

(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

豬 嵴 病 毒（Porcine kobuvirus，PKV）屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）嵴病毒屬（Kobuvirus） 成員[1]，是一種新發(fā)現(xiàn)的無囊膜的單股正鏈RNA病毒，可引起仔豬的病毒性腹瀉。自2010年底以來，我國大部分省份規(guī)模化豬場相繼發(fā)生了以乳豬高發(fā)病率、高死亡率、藥物防治效果差、現(xiàn)有疫苗免疫效果多不明顯為特征的豬病毒性腹瀉疫情[2]。其主要癥狀為哺乳仔豬多在出生2～3 d后先嘔吐，后腹瀉，體質(zhì)量下降及嚴(yán)重脫水，迅速死亡，母豬和育肥豬無明顯癥狀[3]。據(jù)報道，在這次疫情中檢測到病毒主要包括豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diamhea virus，PEDV）、 豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PRoV）、沙波病毒（Sapovirus）、豬博卡病毒（Porcine Boca virus，PBoV）和PKV。雖然研究發(fā)現(xiàn)PEDV在此次腹瀉疫情中占主要地位，但應(yīng)用豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎二聯(lián)疫苗等常規(guī)腹瀉疫苗強(qiáng)化免疫效果并不明顯，而且乳豬腹瀉循環(huán)反復(fù)發(fā)生。此次腹瀉疫情持續(xù)時間長，不僅造成了仔豬成活率降低，感染2周內(nèi)仔豬發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率在80%以上，5日齡內(nèi)的仔豬死亡率更是達(dá)到100%，而且造成飼料轉(zhuǎn)化率降低、日增重低等后果，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害和嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。PKV是否與當(dāng)前的疫情有關(guān)，尚無定論。但由于PKV陽性檢出率相對較高，專家分析可能與其他腸道病毒如PEDV、TGEV和PRoV發(fā)生混合感染或成為疾病發(fā)生的誘導(dǎo)因素，甚至有可能對動物乃至人類健康造成潛在的威脅[5]。因此，及時加強(qiáng)對PKV的研究具有重要的現(xiàn)實意義。本文對PKV的由來和發(fā)現(xiàn)、病毒的分類地位、基因組結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)、流行病學(xué)及檢測方法等研究現(xiàn)狀做一簡要概述，為科研人員對PKV的研究及了解仔豬病毒性腹瀉疫情的整體概況提供參考。

1 病毒的由來和發(fā)現(xiàn)

2007年匈牙利科學(xué)家Reuter等[6]根據(jù)用于擴(kuò)增杯狀病毒RNA依賴的RNA聚合酶基因所設(shè)計的通用引物，在利用RT-PCR方法檢測10日齡以下仔豬腹瀉糞便樣品中否存在豬杯狀病毒屬（Porcine calicivirus）的諾如病毒（Norovirus）和沙波病毒時擴(kuò)增出一條非特異性條帶，序列分析發(fā)現(xiàn)與愛知病毒有一定的同源性，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示屬于嵴病毒屬成員，這是首次在豬糞便中檢測到PKV，我國也于同期分離到了該病毒，這2株分離毒株分別被命名S-1-HUN 和 swine/2007/CHN[7]， 而且這2株毒株也被認(rèn)可為PKV的參考毒株，從此揭開了PKV研究的序幕。此后，PKV在匈牙利、泰國、日本、韓國、巴西和荷蘭等國家相繼被報道，陽性檢出率很高，并且發(fā)現(xiàn)在具有腹瀉癥狀的豬群中，陽性率明顯高于無腹瀉癥狀的豬群[8]。目前關(guān)于PKV的研究相對較少，PKV與人和動物各種疾病的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

2 病毒的分類地位

根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）2013年2月份最新的病毒分類報告，目前小RNA病毒科已包含17個屬，嵴病毒屬包含的3種病毒分別進(jìn)行了重新命名，即人愛知病毒（Aichi virus，AiV）正式更名為愛知病毒A（Aichivirus A），牛嵴病毒（Bovine kobuvirus，BKV）更名為愛知病毒B（Aichivirus B），作為原來的一個候選種，PKV被正式確定為一個新種，被命名為愛知病毒C（Aichivirus C）[9]。目前為止，嵴病毒屬已經(jīng)公認(rèn)的只有這3個種。

3 病毒的流行病學(xué)特點

PKV目前在世界范圍內(nèi)廣泛流行，在腹瀉和健康乳豬群、斷乳仔豬群、肥育豬群、母豬群的糞便或血清樣品中陽性檢出率均很高，在具有腹瀉癥狀的乳豬群中尤甚，而且在這些發(fā)病乳豬中其他常見腹瀉病毒如TGEV、PEDV和PRoV的檢出率并不高。盡管如此，PKV是否與豬的腸道疾病相關(guān)，目前尚無定論。病毒通過何種途徑傳播，目前也沒有確切的證據(jù)證明。有專家認(rèn)為病毒可能從胃腸道系統(tǒng)轉(zhuǎn)入了血液循環(huán)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致病毒血癥，糞-口途徑也可能是PKV的傳播途徑之一。另外，也可能存在其他傳播途徑，如哺乳、血液及食物等[10]。

4 病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

4.1 病毒的分離培養(yǎng)

嵴病毒屬人AiV能在BS-C-1和Vero細(xì)胞上增殖并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，但不能引起人體細(xì)胞如人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）、人胚肺細(xì)胞（HEL細(xì)胞）、人惡性胚胎橫 肌瘤細(xì)胞（RD細(xì)胞）及乳鼠細(xì)胞病變[11]。BKV能在Hela細(xì)胞上增殖并且引起病變[12]。而PKV目前尚未找到合適的培養(yǎng)細(xì)胞，體外培養(yǎng)尚未成功[13]。

4.2 血清學(xué)檢測技術(shù)

日本學(xué)者用抗AiV單克隆抗體建立的ELISA檢測方法，用于檢測糞便中AiV，結(jié)果表明此方法比病毒分離更敏感，比病毒中和試驗更簡便快捷，但迄今并沒有商業(yè)化的試劑盒[14]。Yamashita 等通過電鏡和SDS-PAGE等方法獲得了純化的BKV病毒粒子蛋白并制備抗血清，建立了一種可檢測BKV的ELISA檢測方法。國內(nèi)學(xué)者陳蕾等[15]（2012）對PKV的主要結(jié)構(gòu)蛋白即中和抗體結(jié)合蛋白VP1蛋白進(jìn)行了表達(dá)，并對其主要的抗原表位、二級及三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。該結(jié)果為PKV特異性抗原的免疫印跡和ELISA等血清學(xué)方法的建立提供了科學(xué)的參考依據(jù)，有助于進(jìn)一步推進(jìn)PKV的研究。

4.3 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

4.3.1 PCR技術(shù)

目 前，Reuter等[16]（2009） 根 據(jù)豬嵴病毒屬3種嵴病毒AiV、BKV和PKV的最保守區(qū)域（3D區(qū)域）設(shè)計引物，能成功地檢測到上述3種病毒，這為嵴病毒分子流行病學(xué)的調(diào)查及宿主物種的檢測提供了可能。Khamrin等[13]（2010）于2009年從日本28個豬場的健康豬群采集了293頭份糞便樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果檢出PKV陽性率為45.4%（133/293）。我國自2009年首次檢測到PKV以來，目前多個省市自治區(qū)均有檢測到該病毒的報到。胡軍勇等[17]（2012）根據(jù)PKV的3D基因建立RTPCR方法，并用此法對在湖北省各大豬場采集的165頭份病料進(jìn)行檢測，結(jié)果檢測出陽性樣品118份，在具有腹瀉癥狀的豬群中PKV的陽性率高達(dá)82.5%，而在非腹瀉豬群中PKV的陽性率只有13.23%，并且研究還發(fā)現(xiàn)PKV在仔豬中的陽性率要高于育肥豬和種豬中的陽性率。王長松等（2012）于2010年從位于上海市閔行區(qū)、青浦區(qū)和奉賢區(qū)的3個規(guī)模豬場采集了116頭份豬糞便樣品，經(jīng)RT-PCR檢測，共檢出PKV陽性樣本15份，陽性率為38.8%，3個規(guī)模豬場的陽性率分別為46.7%、35.1%和32.4%，說明上海豬群中PKV感染率較高。張莎等（2013）于2012年利用RT-PCR方法對我國24個省市84個豬場的236頭份病料樣品進(jìn)行PKV檢測。結(jié)果共檢出PKV陽性樣本63份，陽性率為36.69%；而在檢測的84個豬場中，共有36個豬場顯示PKV陽性，豬場陽性率為42.85%，除了我國西北地區(qū)未檢測到PKV之外，其他地區(qū)均檢測到了PKV，并且該病毒在華中和華東地區(qū)流行最為嚴(yán)重。張文波等[18]（2013）根據(jù)PKV的3D基因設(shè)計引物建立RTPCR檢測方法，其最小檢測量可達(dá)2.3 pg。對江西省2010年冬至2012年2月收集的100份仔豬PEDV陽性樣品進(jìn)行PKV檢測，陽性率達(dá)42.86%。李淞等[19]（2013）根據(jù)PKV的3D基因設(shè)計引物建立的RT-PCR方法，最低可以檢出1 pg的病毒核酸，而且該方法在病毒含量較低的情況下，也能準(zhǔn)確檢測出病毒核酸，具有較高的敏感性，能夠有效地對早期感染豬群進(jìn)行診斷和監(jiān)控。高敏感性和特異性引物的設(shè)計成功，為嵴病毒分子流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的技術(shù)支持，敏感性也大大高于ELISA。

4.3.2 實時熒光定量PCR技術(shù)

實時熒光定量PCR同普通PCR相比，具有更高的敏感性，能高效、準(zhǔn)確、快速地檢測出PKV。修金生等（2012）根據(jù)PKV的3D蛋白序列基因設(shè)計引物，建立了檢測PKV的SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR方法。該方法可實時定量分析病毒核酸在動物體內(nèi)的含量來明確其PKV感染水平和確定感染靶器官，同時為PKV的早期診斷提供重要參考。劉孟良等（2013）也建立了檢測PKV的SYBR Green I實時熒光定量RT-PCR方法，其最低檢出拷貝數(shù)為100拷貝，且具有良好的穩(wěn)定性和較高的精確度。

5 展望

PKV是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，它不僅具有傳染性而且在世界范圍內(nèi)廣泛分布，給世界豬業(yè)帶來危害的同時也給科研人員帶來了挑戰(zhàn)和機(jī)遇。目前關(guān)于PKV的研究才剛剛起步，其細(xì)胞感染機(jī)制、流行病學(xué)特征、病毒感染的病理生理學(xué)及免疫學(xué)等方面的研究較少，相關(guān)報道也比較匱乏。盡管普遍認(rèn)為PKV可能感染豬的胃腸道，但在發(fā)生或沒有腹瀉病癥的豬糞便或血清樣品中均能檢測到PKV。這說明PKV可能是條件性常在病毒，感染率高并不能確定其是否與仔豬腹瀉相關(guān)，仍需要病毒分離與動物回歸試驗證實其與仔豬腹瀉的關(guān)系，也可能是因為PKV與其他腸道病毒的混合感染成為疾病發(fā)生的誘因。因此，對嵴病毒的結(jié)構(gòu)和功能、發(fā)病機(jī)制、傳播機(jī)制、致病性、臨床表現(xiàn)、免疫應(yīng)答和基因遺傳演化等方面的深入研究將成為未來嵴病毒研究的重點，只有這樣才能有助于對PKV的真正認(rèn)識和有效防控。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對嵴病毒的認(rèn)識會越來越深刻，將會得到更多仔豬病毒性腹瀉的相關(guān)知識，對于規(guī)模性豬場防控仔豬腹瀉提供更全面及時的信息和更多有用的方法和技術(shù)。

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