SIRT6和HIF-1α在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及臨床價(jià)值

葛忠耀 田寅 王博 胡少軍 尹佳新 劉應(yīng)紅 徐雷

摘要：目的? 探索SIRT6基因與缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達(dá)關(guān)系，分析二者相關(guān)性及臨床價(jià)值。方法? 收集2017年6月～2018年12月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科60例TNBC乳腺癌組織及其對(duì)應(yīng)60例腋窩淋巴結(jié)病理組織，并取癌旁正常組織40例。采用免疫組化法檢測(cè)癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁組織中SIRT6、HIF-1α表達(dá)，分析二者表達(dá)與TNBC乳腺癌臨床病理參數(shù)、發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及二者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果? SIRT6在TNBC乳腺癌組織中表達(dá)陽性率（80.00%）高于癌旁組織（24.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其表達(dá)與TNBC乳腺癌組織分化程度，臨床TNM分期、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有關(guān)（P<0.05）;在TNBC乳腺癌組織、癌旁組織中HIF-1α的陽性率分別為86.67%、15.00%。且HIF-1α在TNBC乳腺癌組織與癌旁組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。并與TNBC乳腺癌的組織分化程度，臨床TNM分期、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)相關(guān)（P<0.05）;在TNBC乳腺癌中SIRT6與HIF-1α的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.823，P<0.05）。結(jié)論? 在TNBC乳腺癌中SIRT6與HIF-1α的較高的陽性表達(dá)率可能與其發(fā)生發(fā)展及早期轉(zhuǎn)移有關(guān)，檢測(cè)SIRT6與HIF-1α將有助于了解TNBC乳腺癌的進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移情況，它們有希望為TNBC乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療及預(yù)后的評(píng)估提供新的研究思路。

關(guān)鍵詞：SIRT6;HIF-1α;TNBC乳腺癌;免疫組織化學(xué)

中圖分類號(hào)：R737.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.05.028

文章編號(hào)：1006-1959（2019）05-0095-03

Abstract：Objective? To explore the relationship between SIRT6 gene and hypoxia-inducible factor （HIF-1α） in triple negative breast cancer （TNBC）， and to analyze their correlation and clinical value. Methods? A total of 60 TNBC breast cancer tissues and 60 corresponding axillary lymph node tissues were collected from the Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of Jiamusi University from June 2017 to December 2018， and 40 normal tissues adjacent to the cancer were collected. The expressions of SIRT6 and HIF-1α in cancer tissues， metastatic lymph nodes and paracancerous tissues were detected by immunohistochemistry. The relationship between the expression of SIRT6 and HIF-1α in TNBC breast cancer and the relationship between them were analyzed. Results? The positive rate of SIRT6 expression in TNBC breast cancer tissues （80.00%） was higher than that in adjacent tissues （24.00%）. The difference was statistically significant （P<0.05），the expression was correlated with the degree of TNBC breast cancer differentiation， clinical TNM stage and metastatic lymph nodes （P<0.05）. The positive rates of HIF-1α in TNBC breast cancer tissues and adjacent tissues were 86.67% and 15.00%， respectively. The expression of HIF-1α in TNBC breast cancer tissues and adjacent tissues was statistically significant （P<0.05）.It was associated with the degree of tissue differentiation， clinical TNM stage and metastatic lymph nodes of TNBC breast cancer （P<0.05）. There was a positive correlation between SIRT6 and HIF-1α expression in TNBC breast cancer（r=0.823，P<0.05）. Conclusion? The higher positive expression rate of SIRT6 and HIF-1α in TNBC breast cancer may be related to its development and early metastasis. Detection of SIRT6 and HIF-1α will help to understand the progression and invasion and metastasis of TNBC breast cancer. I hope to provide new research ideas for the early detection， treatment and prognosis evaluation of TNBC breast cancer.

Key words：SIRT6;HIF-1α;TNBC breast cancer;Immunohistochemistry

乳腺癌（breast cancer）在女性惡性腫瘤屬高發(fā)疾病，三陰性乳腺癌（TNBC）在組織分型中具有惡性程度高，預(yù)后差的特點(diǎn)，尤其受到重視。腫瘤具有基因組不穩(wěn)定、細(xì)胞增殖不可控和主要通過無氧呼吸提供能量等重要特征，且腫瘤細(xì)胞中的大多數(shù)即使在有充足氧氣的條件下，依然可以通過產(chǎn)能率極低的糖酵解作用來提供能量[1]。SITR6在維持基因組穩(wěn)定、調(diào)控糖代謝等方面都發(fā)揮重要作用，可能對(duì)腫瘤具有調(diào)控作用。HIF-1α可以調(diào)節(jié)多種基因來激活糖酵解，同時(shí)抑制線粒體呼吸作用。有研究報(bào)道SIRT6 基因缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞糖酵解增強(qiáng)、有氧呼吸被抑制、HIF-1α的合成和穩(wěn)定性增強(qiáng)[2]。本研究通過免疫組織化學(xué)方法測(cè)驗(yàn)SIRT6、HIF-1α兩因子在TNBC乳腺癌中的表達(dá)情況，分析二者表達(dá)與TNBC乳腺癌臨床病理參數(shù)、發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及二者表達(dá)的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1材料? 收集2017年6月～2018年12月佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科TNBC乳腺癌組織及其對(duì)應(yīng)腋窩淋巴結(jié)病理組織各60例，研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。在此60例標(biāo)本中隨機(jī)抽取其中癌旁2 cm正常組織（鏡下無癌）40例。所有患者術(shù)前均未予以新輔助化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療，術(shù)后病理診斷明確，上述標(biāo)本均按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)制作石蠟包埋切片。

1.2試劑? 試劑包含兔抗人SIRT6多克隆抗體，鼠抗人HIF-1α單克隆抗體，免疫組化染色超敏試劑盒和DAB顯色試劑，PBS磷酸鹽緩沖液緩沖液，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3方法? 采用免疫組化SP法。操作步驟按說明書進(jìn)行。脫蠟、水化，PBS洗2次各5 min，用蒸餾水或 PBS 配制新鮮的 3% H2O2，室溫封閉5～10 min，用蒸餾水洗3次，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，滴加Ⅰ抗50 μl，室溫靜置1 h或4℃過夜或37℃ 1 h、PBS洗3次各2 min。滴加生物素化Ⅱ抗，20℃ 20 min，PBS洗3次各2 min。滴加試劑SABC 20℃ 20 min，PBS 洗4次各5 min，DAB 顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色，脫水、透明、封片、鏡檢。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.4觀察指標(biāo)? 計(jì)算SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺組織標(biāo)本、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁組織中的表達(dá)陽性率，分析二者的表達(dá)結(jié)果與患者的年齡、腫瘤生長大小、是否絕經(jīng)等因素的關(guān)系，以及與癌組織的分化水平、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是否存在相關(guān)性。

1.5評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)? 在高倍鏡下進(jìn)行觀察癌細(xì)胞數(shù)量，SIRT6、HIF-1α均以細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)染色。幾乎不染色為陰性（-）;且淺黃為弱陽性（+）;棕黃染陽性（++）;深棕染強(qiáng)陽性（+++）。Sirt6蛋白和HIF-1α蛋白在乳腺癌組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和著色深度計(jì)分，每例均隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（×400），確定每個(gè)視野的陽性率，取平均數(shù)，按下列計(jì)分：陽性細(xì)胞≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。陽性細(xì)胞表達(dá)的著色深度：基本不著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)積分相乘：≥1為陽性，<1為陰性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 所有數(shù)據(jù)、結(jié)果均用Excel錄入，SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用？字2檢驗(yàn)四格表資料的Fisher確切概率法、多組等級(jí)比較采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺中的表達(dá)? SIRT6在TNBC乳腺癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁組織均有表達(dá)，前兩者均高于后者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=29.803，P<0.05）。HIF-1α在TNBC乳腺癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及癌旁組織均有表達(dá)，前者兩者均高于后者， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=50.602，P<0.05），見表1。

2.2 SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺癌組織中的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系? ?SIRT6與TNBC乳腺癌組織的分化水平、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P<0.05），與患者的年齡、腫瘤生長大小及是否絕經(jīng)無相關(guān)性（P>0.05）;HIF-1α與TNBC乳腺癌的組織分化水平、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P<0.05），而與患者的年齡、腫瘤生長大小及是否絕經(jīng)無相關(guān)性（P>0.05），見表2。

2.3 TNBC乳腺癌組織和癌旁組織中SIRT6、HIF-1α表達(dá)相關(guān)性分析? 兩者均在癌組織中出現(xiàn)高表達(dá)，且在癌旁組織中出現(xiàn)低表達(dá)。結(jié)果顯示SIRT6、HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)性（r=0.823），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3討論

腫瘤細(xì)胞的持久分裂能力和導(dǎo)致人體衰老死亡的過程看起來似乎是對(duì)立狀態(tài)，但事實(shí)上癌變和衰老過程中的分子變化以及細(xì)胞層面的生物學(xué)基礎(chǔ)卻是極為相似[3]。SIRT6在癌變過程中起到非常重要的作用，研究表明，SIRT6 的缺失使得糖酵解增加并通過某些途徑使之上調(diào)了相關(guān)基因的表達(dá)，刺激和促進(jìn)了核糖體的生成，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的異常增殖，這表明其在腫瘤的形成以及維持過程中起到非常重要的作用[4]。除此之外，通過臨床樣本的數(shù)據(jù)分析，可以發(fā)現(xiàn) SIRT6 在多種惡性腫瘤疾病中的表達(dá)水平與患者的生存、預(yù)后密切相關(guān)[5]。HIF-1是具有轉(zhuǎn)錄活性的一種核蛋白，擁有廣泛的靶基因譜。HIF-1α基因定位于人的14 號(hào)染色體，受缺氧信號(hào)的直接調(diào)控，其作為HIF-1的活性亞基，HIF-1α是組織缺氧區(qū)域內(nèi)的最重要的標(biāo)記物，是調(diào)控細(xì)胞代謝途徑轉(zhuǎn)換過程的重要因子，有學(xué)者推測(cè)SIRT6可通過影響HIF-1α表達(dá)調(diào)控Warburg效應(yīng)[6]，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞分化增殖活性的調(diào)控。

目前，SIRT6和HIF-1α蛋白聯(lián)合監(jiān)測(cè)在宮頸癌、肝癌、胃癌中的表達(dá)相關(guān)研究較多，二者可作為腫瘤標(biāo)志物監(jiān)測(cè)肝癌、胃癌的演變[7]。但關(guān)于兩種蛋白SIRT6和HIF-1α聯(lián)合檢測(cè)在乳腺癌中的研究鮮見報(bào)道。同時(shí)，可以推測(cè)SIRT6是否能加強(qiáng)HIF-1α對(duì)多種糖酵解相關(guān)酶如PFK1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1等的影響，從而加快細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)換過程，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖。具體實(shí)驗(yàn)步驟需進(jìn)一步設(shè)計(jì);如果這個(gè)推論成立，將可能對(duì)TNBC乳腺癌的治療提供更多的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺癌組織，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的陽性率均高于癌旁正常組織的陽性率，揭示其在TNBC乳腺癌的惡變與轉(zhuǎn)移中能夠起到促成作用。在60例TNBC乳腺癌中，SIRT6、HIF-1α在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率高于無結(jié)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）;說明SIRT6、HIF-1α可能與TNBC乳腺癌淋巴結(jié)的侵襲轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。并且SIRT6、HIF-1α在TNBC乳腺癌的組織分化程度、臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），而與患者年齡、是否絕經(jīng)及腫瘤大小無相關(guān)性（P>0.05）;證明了過表達(dá)的SIRT6、HIF-1α對(duì)TNBC乳腺癌的進(jìn)展過程可能起到一定作用，可認(rèn)為是TNBC患者預(yù)后不良的標(biāo)志。最后在TNBC癌組織中SIRT6、HIF-1α呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.823，P<0.05）。提示兩者在TNBC乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起到協(xié)同作用，并且SIRT6能上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)也預(yù)示在其高表達(dá)時(shí)有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可能，為TNBC乳腺癌治療提供新的靶點(diǎn)及研究方向。

綜上所述，TNBC乳腺癌組織中SIRT6和HIF-1α的表達(dá)升高，且其協(xié)同參與TNBC乳腺癌的進(jìn)展和復(fù)發(fā)，檢測(cè)二者對(duì)于指導(dǎo)TNBC乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療及預(yù)后具有重要參考意義。然而，本次研究樣本量較少，不同地域、種族等可能會(huì)存在差異，相關(guān)研究結(jié)論有待大樣本、多中心的研究進(jìn)一步去證實(shí)。

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收稿日期：2018-11-29;修回日期：2018-12-12

編輯/肖婷婷