庫(kù)買(mǎi)提杏中主要類胡蘿卜素的組成和含量分析

杜彬花，熱合滿·艾拉，陳 琪，謝 蕊，黃亞?wèn)|，黃文書(shū),3,*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)博士后流動(dòng)站，新疆 烏魯木齊 830052）

杏（Prunus armeniacaL.）屬薔薇科（Rosaceae），原產(chǎn)中國(guó)。我國(guó)蘊(yùn)藏著豐富的杏類胡蘿卜素資源，據(jù)2016年統(tǒng)計(jì)，新疆杏種植面積達(dá)187.6萬(wàn) 畝，產(chǎn)量達(dá)119.8萬(wàn) t[1]，居全國(guó)首位，被稱為世界四大杏產(chǎn)區(qū)之一[2]，其中庫(kù)買(mǎi)提杏因其具有香氣濃郁、果肉厚、纖維少、可溶固形物含量高、甜酸適口、果肉細(xì)膩滑潤(rùn)等特點(diǎn)，最為出名，具有優(yōu)良的加工品質(zhì)和廣闊的商業(yè)價(jià)值。

類胡蘿卜素在預(yù)防心血管疾病、癌癥以及黃斑變性等方面有重要作用，且必須通過(guò)飲食攝取[3-5]。杏是類胡蘿卜素含量最為豐富的水果之一[6-8]，也是人體攝取類胡蘿卜素的重要來(lái)源[9]。Kurz等[10]應(yīng)用高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-質(zhì)譜測(cè)定了來(lái)自法國(guó)和西班牙等地的6 個(gè)杏品種中的類胡蘿卜素，結(jié)果表明不同杏品種在類胡蘿卜素種類和含量上均有較大差異；Zaghdoudi等[11]應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-質(zhì)譜技術(shù)分析比較了杏中類胡蘿卜素種類的組成，發(fā)現(xiàn)杏中主要的類胡蘿卜素為全反式-β-胡蘿卜素；Ruiz等[12]研究了歐洲37 個(gè)杏品種果皮以及果肉中的類胡蘿卜素種類及含量，結(jié)果表明杏中主要類胡蘿卜素為β-胡蘿卜素、β-隱黃素、γ-胡蘿卜素?；莶13]、陳潔瓊[14]和樊金玲[15]等鑒定了西瓜、玉米籽和榆樹(shù)葉中類胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)西瓜中類胡蘿卜素組成主要為非極性類胡蘿卜素，玉米籽和榆樹(shù)葉中主要含極性類胡蘿卜素；陶俊等[16]利用高效液相色譜法研究了53 個(gè)柑橘品種果實(shí)及果皮中主要類胡蘿卜素成分及含量，結(jié)果表明果皮和果實(shí)中類胡蘿卜素構(gòu)成相同。綜上所述，國(guó)外對(duì)杏中類胡蘿卜素鑒定的研究多集中于歐洲杏品種，未涉及中國(guó)杏；國(guó)內(nèi)對(duì)類胡蘿卜素的研究還處于總量分析階段，定性分析報(bào)道較少，且針對(duì)杏中類胡蘿卜素的定性研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以新疆庫(kù)買(mǎi)提杏為研究對(duì)象，利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-大氣壓化學(xué)電離-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-diode array detection-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry，HPLC-DAD-APCI-MS）技術(shù)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式檢測(cè)，獲取類胡蘿卜素化合物HPLC、MS及光譜信息并與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，確定新疆庫(kù)買(mǎi)提杏中主要類胡蘿卜素成分，采用外標(biāo)法進(jìn)行類胡蘿卜素定量，研究結(jié)果為提升新疆杏果及其產(chǎn)品品質(zhì)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要的意義，為合理開(kāi)發(fā)和利用新疆杏資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

庫(kù)買(mǎi)提杏于2018年6月購(gòu)于新疆烏魯木齊市北園春水果市場(chǎng)，選取杏果果皮顏色由綠色自然轉(zhuǎn)為全黃，并且大小均勻的完好無(wú)損的果實(shí)，用小刀切分為兩瓣，去核，用液氮快速冷凍，置于-20 ℃冰箱備用。

標(biāo)準(zhǔn)品：全反式-β-胡蘿卜素（UV≥97%）、全反式-β-隱黃素（HPLC≥97%）、全反式-α-胡蘿卜素（HPLC≥98%），甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）、甲醇（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；丙酮、石油醚、抗氧化劑2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-ditertbutyl-4-methylphenol，BHT）、無(wú)水硫酸鈉（均為分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16G高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器有限公司；FA2104N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；InertsilC30色譜柱 日本島津（中國(guó)）公司；N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司；Triple Quad LC/MS 6410 HPLC-DAD-APCI-MS聯(lián)用儀（HPLC儀、真空脫氣機(jī)、四元梯度洗脫泵、柱溫箱、DAD、三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、APCI離子源） 美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素的提取

用液氮快速冷凍已去核杏果并研磨至粉末，精確稱取10 g至磨口錐形瓶中，加入85%丙酮溶液[7]150 mL（含0.1% BHT）避光超聲浸提15 min，重復(fù)浸提至殘?jiān)鼰o(wú)色后合并浸提液，離心15 min（4 ℃、8 000 r/min），將上清液收集于分液漏斗中，加500 mL石油醚進(jìn)行萃取，待分層后分流水相，有機(jī)相用盛有40 g無(wú)水硫酸鈉的漏斗收集至圓底燒瓶中，真空25 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，流動(dòng)相復(fù)溶最終產(chǎn)物并定容至5 mL棕色容量瓶，低溫避光保存待用，進(jìn)樣前使用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。

1.3.2 類胡蘿卜素的HPLC-DAD-APCI-MS定性分析

HPLC條件參照Huang Wenshu[7]和Etzbach[17]等的方法，并略作改進(jìn)。流動(dòng)相A為甲醇-MTBE-水（81∶15∶4，V/V），流動(dòng)相B為甲醇-MTBE-水（7∶90∶3，V/V），AB相中分別含0.1% BHT；流速1 mL/min；線性梯度洗脫，B相在0～100 min內(nèi)體積分?jǐn)?shù)由0%增至100%；C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；DAD光譜收集范圍300～500 nm。

MS條件：APCI正離子源；MRM掃描；質(zhì)譜流速1 mL/min；干燥氣體流速4 L/min；毛細(xì)管電壓2 500 V；霧化氣壓力30 psi；汽化溫度350 ℃；蒸汽溫度320 ℃；電暈電流4 μA。

1.3.3 庫(kù)買(mǎi)提杏中類胡蘿卜素的定量分析

采用1.3.2節(jié)HPLC條件，有標(biāo)準(zhǔn)品的全反式類胡蘿卜素組分，采用外標(biāo)法定量分析類胡蘿卜素，順式類胡蘿卜素組分無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品，但其消光系數(shù)與全反式相似，故根據(jù)替換計(jì)算法[18]：采用對(duì)應(yīng)的全反式類胡蘿卜素曲線方程對(duì)類胡蘿卜素的異構(gòu)體進(jìn)行定量，結(jié)果以庫(kù)買(mǎi)提杏干質(zhì)量計(jì)算（μg/g）。

分別準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為500、400、200 μg/mL的β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、β-隱黃素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，各吸取1 000、125、50 μL并用流動(dòng)相定容至10 mL容量瓶中，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋為系列質(zhì)量濃度工作液，重復(fù)3 次HPLC檢測(cè)。以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（表1）。

表1 類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Standard curves for carotenoids

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 庫(kù)買(mǎi)提杏中全反式類胡蘿卜素的分析鑒定

本研究綜合類胡蘿卜素HPLC、MS[19]及光譜信息，并結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)庫(kù)買(mǎi)提杏中主要類胡蘿卜素組分進(jìn)行鑒定分析。

圖1 類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（a～c）和樣品（d）HPLC圖Fig. 1 HPLC profiles of carotenoid standards (a-c) and carotenoids (d)in sample

與標(biāo)準(zhǔn)品（圖1a～c）對(duì)比，圖1d中峰3、6、7的保留時(shí)間分別為25.9、31.9、36.0 min，初步判斷峰3、6、7分別為與全反式-β-隱黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素。

由圖2a、b可知，β-隱黃素的分子離子峰為m/z553.5，碎片離子峰為m/z177.2、119.1；β-胡蘿卜素的分子離子峰為m/z537.5，碎片離子峰為m/z177.2、119.1、413.4。選擇m/z553.5、537.5為母離子，進(jìn)行選擇離子監(jiān)測(cè)掃描（selected ion monitoring，SIM），如圖2c所示，其與圖1峰形基本一致，而SIM掃描具有僅允許設(shè)定離子通過(guò)的特異性，這說(shuō)明SIM圖中峰1～8可能均為β-隱黃素和β-胡蘿卜素的同分異構(gòu)體；選擇母離子-子離子定性離子對(duì)：m/z553.5～177.2，m/z553.5～119.1為β-隱黃素的定性離子對(duì)，選擇m/z537.5～177.2、537.5～119.1、537.5～413.4為β-胡蘿卜素的定性離子對(duì)，對(duì)樣品進(jìn)行MRM。如圖2d所示，圖2c、d峰形一致，而MRM掃描模式對(duì)母離子和子離子具有雙重質(zhì)量篩選，僅允許符合設(shè)定規(guī)則的離子通過(guò)[20]，即僅對(duì)符合規(guī)則的離子進(jìn)行信號(hào)記錄，這進(jìn)一步說(shuō)明MRM中峰1～8均為β-隱黃素、β-胡蘿卜素的同分異構(gòu)體。對(duì)峰1～8提取離子獲取其MS信息，由表2可知，峰1～3為β-隱黃素的同分異構(gòu)體，峰4～8為β-胡蘿卜素的同分異構(gòu)體。

圖2 類胡蘿卜標(biāo)準(zhǔn)品（a、b）和庫(kù)買(mǎi)提杏中類胡蘿卜素（c、d）HPLC-MS總離子流圖Fig. 2 Total ion current (TIC) chromatograms of carotenoid standards(a, b) and carotenoids (c, d) in Kumaiti apricot

表2 庫(kù)買(mǎi)提杏中類胡蘿卜素光譜和質(zhì)譜信息Table 2 Chromatographic, UV-visible spectroscopic and mass spectral characteristics of carotenoids from Kumaiti apricot

本實(shí)驗(yàn)中由于MRM只對(duì)選定的特異離子進(jìn)行質(zhì)譜信號(hào)的采集，顯著降低了噪音干擾信號(hào)，提高了檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和重復(fù)性，其中測(cè)得類胡蘿卜素特征碎片離子與文獻(xiàn)報(bào)道相符，m/z535.5表示含羥基的β-隱黃素分子[24]，m/z400表示含β-紫羅酮環(huán)的β-隱黃素分子[25]，m/z119.1表示β-隱黃素分子中C9—C10與C13’—C14’兩個(gè)片段間斷裂產(chǎn)生的特征離子[26]。m/z119.1、177.2和359、400、445分別為β-胡蘿卜素分子C9—C10斷裂[27-28]，一分子末端亞甲基環(huán)[M+H]-137[24,29]，多烯鏈上失去一分子甲苯m/z92所得[30]。

2.2 庫(kù)買(mǎi)提杏中類胡蘿卜素異構(gòu)體的分析鑒定

圖3 庫(kù)買(mǎi)提杏中β-胡蘿卜素及其異構(gòu)體紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig. 3 UV-Visible absorption spectra of β-carotene and its isomers in Kumati apricot

由于類胡蘿卜素異構(gòu)體間分子質(zhì)量相同，僅根據(jù)質(zhì)譜圖無(wú)法判別其歸屬，還需結(jié)合其紫外-可見(jiàn)光譜特征、HPLC洗脫順序及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行鑒定[31]。首先獲取到每個(gè)組分的質(zhì)譜信息，明確分子質(zhì)量后，再結(jié)合光譜特征判斷歸屬[32]，國(guó)內(nèi)外研究中，廣泛采用Q值作為異構(gòu)體光譜特征的判定依據(jù)[33]。結(jié)合圖3和圖1可知，圖1d中的HPLC峰4、5、6、8具有共同的特征離子峰[M+H]+（m/z537.5），為β-胡蘿卜素異構(gòu)體。由表2可知，峰6的3 個(gè)最大吸收波長(zhǎng)分別為424、443、470 nm，與α-胡蘿卜素光譜特征相符[34]，故峰6為α-胡蘿卜素；峰4、5、8最大吸收波長(zhǎng)分別為447、443、446 nm，與峰7（全反式-β-胡蘿卜素）相比發(fā)生了4、8、5 nm左右的“紫移”，且其吸收光譜在近紫外區(qū)330～340 nm處有順式吸收峰，與類胡蘿卜素單順式異構(gòu)體特征相符。根據(jù)前人研究結(jié)果，在同一流動(dòng)相中越早洗脫出的順式異構(gòu)體，其順式雙鍵的位置越靠近分子中心[35]，順式峰吸收強(qiáng)度越大（Q值越大），為中心異構(gòu)體的概率越大[36]，并且15-或13-順-β-胡蘿卜素具有約在340 nm波長(zhǎng)處存在強(qiáng)吸收峰[37]的特點(diǎn)。結(jié)合峰4出峰順序特征及光譜特征：峰4在β-胡蘿卜素的異構(gòu)體中HPLC最早出峰，具有最大Q值，且在340 nm波長(zhǎng)處有順式吸收峰，再結(jié)合其最大吸收波長(zhǎng)，可判定峰4為中心異構(gòu)體：15-順式-β-胡蘿卜素；由β-胡蘿卜素異構(gòu)體的洗脫規(guī)律[27,38]可知：13-和15-順式異構(gòu)體均在全反式之前出峰，9-順式異構(gòu)體在全反式之后出峰，結(jié)合Q值及光譜信息，可判定峰5為13-順式-β-胡蘿卜素，峰8為9-順式-β-胡蘿卜素。

峰1、2能提取到[M+H]+（553.5），為β-隱黃素的異構(gòu)體。β-隱黃素結(jié)構(gòu)相比β-胡蘿卜素，紫羅酮環(huán)上多一個(gè)羥基基團(tuán)，但二者具有相同的異戊二烯結(jié)構(gòu)主鏈性質(zhì)[39]，故在同一流動(dòng)相中其對(duì)應(yīng)位置異構(gòu)體的色譜洗脫順序與β-胡蘿卜素應(yīng)具有一致性，結(jié)合其光譜信息，初步判定峰1、2分別為15-順式-β-隱黃素、13-順式-β-隱黃素。

Aman等[40]應(yīng)用HPLC-MS-核磁共振技術(shù)分離并鑒定了9-順式和13-順式玉米黃素，Strohschein等[41]通過(guò)HPLC-1H核磁共振鑒定出7 種β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體。它們的洗脫順序依次都為9-順式、全反式、13-順，與本研究結(jié)果一致；Koyama等[42]在順式異構(gòu)體的研究中發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)順序依次為：全反式-β-胡蘿卜素＞15-順式-β-胡蘿卜素＞13-順式-β-胡蘿卜素，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，（全反式-β-胡蘿卜素（451 nm）＞15-順式-β-胡蘿卜素（447 nm）＞13-順式-β-胡蘿卜素（443 nm））。

2.3 庫(kù)買(mǎi)提杏中類胡蘿卜素含量分析

采用HPLC法、外標(biāo)法測(cè)定了庫(kù)買(mǎi)提杏（2018年6月）中各類胡蘿卜素組分含量，庫(kù)買(mǎi)提杏中總類胡蘿卜素含量為170 μg/g，其中β-胡蘿卜素和其異構(gòu)體為158.3 μg/g，占總類胡蘿卜素的比例為93.2%，β-隱黃素和其異構(gòu)體含量為11.7 μg/g，其所占總類胡蘿卜素的比例為6.8%。而順式類胡蘿卜素異構(gòu)體約占總含量的24.8%，其中9-順式-β-胡蘿卜素是含量最高的順式類胡蘿卜素，是全反式α-胡蘿卜素的2 倍，這與Kurz等[10]研究結(jié)果相近。順式類胡蘿卜素在熱與光照的條件下生成[26]，本實(shí)驗(yàn)在測(cè)定過(guò)程中均采用室溫避光措施，因此鮮杏中順式類胡蘿卜素異構(gòu)體含量較高可能是植物體中本身存在的，目前已有許多研究證明植物中存在順式異構(gòu)體，在眾多水果中也有發(fā)現(xiàn)[6]。

順式與反式異構(gòu)體生理活性有較大差異。李京[43]、仇丹[44]等發(fā)現(xiàn)：小鼠血液中的總順式番茄紅素比例超過(guò)60%，其在體內(nèi)的抗氧化性反而高于全反式異構(gòu)體，9-順-蝦青素在清除自由基方面效果更優(yōu)于全反式。但β-胡蘿卜素作為最具有VA原活性的類胡蘿卜素之一，其順式異構(gòu)體13-順和9-順的VA原活性則分別只有全反式-β-胡蘿卜素的53%和38%[45]，含有較高順式類胡蘿卜素異構(gòu)體，將降低其生理活性。

3 結(jié) 論

庫(kù)買(mǎi)提杏中主要的全反式類胡蘿卜素為β-胡蘿卜素（114 μg/g），其次為α-胡蘿卜素（8.3 μg/g），含少量β-隱黃素（5.4 μg/g）；主要的順式類胡蘿卜素異構(gòu)體為β-胡蘿卜素異構(gòu)體（9-順式、13-順式和15-順式）和β-隱黃素異構(gòu)體（13-順式和15-順式）。其中9-順式-β-胡蘿卜素含量高達(dá)18.8 μg/g，是庫(kù)買(mǎi)提杏中含量最高的順式類胡蘿卜素。