HPLC法同時(shí)測(cè)定藍(lán)花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素的含量

張寬　曾茂貴　羅蘭　李穎　葉華　張文清

【摘 要】 目的：采用HPLC法同時(shí)測(cè)定藍(lán)花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素的含量，為該藥材的深入研究及資源開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。方法：采用HPLC-DAD法測(cè)定蘆丁、橙皮苷及槲皮素含量，檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm，乙腈（A）-0.5%乙酸水（B）溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果：蘆丁：y=0.128x+0.279（r=0.9970），線性范圍為3.848～48.10μg/mL;橙皮苷：y=0.101x+0.401（r=0.9965），線性范圍為4.144～82.88μg/mL;槲皮素：y=0.097x+0.007（r=0.9990），線性范圍為1.02～6.12μg/mL。結(jié)論：該法精密度、準(zhǔn)確性良好，方法簡(jiǎn)便快捷，可用于藍(lán)花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 藍(lán)花參;HPLC;蘆丁;橙皮苷;槲皮素

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）12-0042-04

Qualitative Analysis of the Rutin， Hesperidin and Quercetin from Wahlenbergia Marginata （Thunb.） A.DC. by? HPLC

ZHANG Kuan1 ZENG Maogui1 LUO Lan2 LI Ying1 YE Hua1 ZHANG Wenqing3

1.The Second Peoples Hospital of Fujian province，F(xiàn)uzhou 350003，China;2.Fujian Health College，F(xiàn)uzhou 350101，China;3.Fujian Provincial Governmental Hospital Fuzhou 350101，China

Abstract：Objective To provide a reference for resource development about Wahlenbergia marginata（Thunb.）A.DC.by qualitative analysis of the rutin， hesperidin and quercetin from this medicinal herb. Methods The content of rutin， hesperidin and quercetin was determined by HPLC-DAD with mobile phase of acetonitrile（A）-0.5% acetic acid（B） for gradient elution and detection wavelength of 268 nm. Result Rutin：y=0.128x+0.279（r=0.9970），linear range：3.848～48.10μg/mL; hesperidin：y=0.101x+0.401（r=0.9965），linear range：4.144～82.88μg/mL; quercetin：y=0.097x+0.007（r=0.9990），linear range：1.02～6.12μg/mL. Conclusion The method is accurate， simple and rapid， and can be used for the determination of the rutin， hesperidin and quercetin in Wahlenbergia marginata（Thunb.）A.DC.

Key words： Wahlenbergia marginata （Thunb.） A.DC.;HPLC; Rutin;Hesperidin;Quercetin

藍(lán)花參[Wahlenbergia marginata （Thunb.） A. DC.]為桔?？扑{(lán)花參屬的植物，以根或全草入藥，具有益氣健脾，祛痰止咳等功效，臨床上常用于治療感冒、氣管炎、痢疾、百日咳[1]等疾病。藥理學(xué)研究顯示：藍(lán)花參具有止咳化痰、消炎鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)胃及其改善胰島素抵抗的藥理作用[2-8]。目前已知藍(lán)花參中化學(xué)成分包括甾體類、多炔類、揮發(fā)油、苯丙素類、黃酮類及萜類化合物[4，9-16]。其中周向文[4]從藍(lán)花參醇提取物中分離出單體化合物，后經(jīng)過(guò)波譜學(xué)分析并鑒定單體化合物8個(gè)，其中五個(gè)化合物為黃酮類，包括farobin B、異牡荊素、蘆丁、3′-甲氧基-5，7-二羥基黃酮-6-C-波伊文糖-4′-O-葡糖糖苷和異牡荊素2′′-O-鼠李糖苷。而課題組的前期研究工作則首次采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)藍(lán)花參進(jìn)行分析，初步鑒定了藍(lán)花參中的6個(gè)化學(xué)成分，均為黃酮類，分別是紫云英苷、蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮苷、槲皮素、芹菜苷[15-16]，說(shuō)明黃酮類成分為藍(lán)花參主要成分之一。鑒于多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量能在一定程度能更全面且準(zhǔn)確的對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，課題組建立HPLC法同時(shí)測(cè)定藍(lán)花參中蘆丁、橙皮苷及槲皮素含量方案，為藍(lán)花參的資源開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 戴安U3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）; SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）;SB4200DT超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）;BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 藍(lán)花參全草干品（批號(hào)：14010507，福州回春中藥飲片廠有限公司）經(jīng)福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系朱扶蓉副教授鑒定為[Wahlenbergia marginata （Thunb.） A.DC.]。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201610）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-201509）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-201115）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 流動(dòng)相乙腈（A）-0.5%乙酸水（B），梯度洗脫（0～5min，10%～15%A;5～10min，15%～17%A;10～20min，17%～20%A;20～30min，20%～20%A;30～40min，20%～30%A;40～45min，30%～40%A;45～55min，40%～60%A;55～60min，60%～10%A;60～65min，10%～10%A）;流速：1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)268nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量10μL，見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品9.620mg、橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品10.36mg、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品10.20mg，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，得到濃度分別為0.9620、1.036、1.020mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密吸取各對(duì)照品貯備液適量于同一量瓶中，甲醇稀釋得混合對(duì)照品溶液（濃度分別為19.24、41.44、10.20μg/mL）。

2.3 供試品溶液制備 精密稱定藍(lán)花參藥材約2.0g，加入40%乙醇50mL，精密稱定，超聲30min，取出，放至室溫，補(bǔ)足重量，0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密量取蘆丁、橙皮苷、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，稀釋成一系列各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以各對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)x，峰面積（A）為縱坐標(biāo)y，得回歸方程。蘆?。簓=0.128x+0.279（r=0.9970），線性范圍為3.848～48.10μg/mL;橙皮苷：y=0.101x+0.401（r=0.9965），線性范圍為4.144～82.88μg/mL;槲皮素：y=0.097x+0.007（r=0.9990），線性范圍為1.02～6.12μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。蘆丁、橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為0.19%，0.37%，0.50%，表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定藍(lán)花參藥材約2.0g，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，于0、1.5、3，6、9、12h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。蘆丁、橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為0.61%、0.51%、1.54%，說(shuō)明該供試品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定藍(lán)花參藥材約2.0g共6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。蘆丁的平均含量為511.418μg/g，RSD為0.59%;橙皮苷的平均含量為698.209μg/g，RSD為0.47%;槲皮素的平均含量為118.184μg/g，RSD為0.76%。說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同批藍(lán)花參藥材6份，每份1.0g，均精密加入蘆丁、橙皮苷、槲皮素混合對(duì)照品溶液適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。蘆丁、橙皮苷、槲皮素的平均加樣回收率分別為99.68%、97.63%、98.71%，RSD分別為1.61%、1.39%、1.45%。說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性高，見(jiàn)表1至表3。

2.9 樣品測(cè)定 精密稱取藍(lán)花參2g，按照上述實(shí)驗(yàn)條件平行測(cè)定三份。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：蘆丁、橙皮苷、槲皮素含量的平均提取量分別為480.243、780.552、132.469μg/g，三次驗(yàn)證試驗(yàn)的RSD分別為0.81%、0.62%、1.2%。

3 討論

由于乙醇對(duì)黃酮類成分的溶解性高[17]，有助于有效成分的提取，故本次實(shí)驗(yàn)采用乙醇作為溶媒對(duì)藍(lán)花參中的黃酮類成分進(jìn)行提取。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇-0.03%甲酸水、乙腈-0.2%乙酸水、甲醇-0.1%甲酸水均可作為同時(shí)測(cè)量蘆丁、橙皮苷及槲皮素含量的流動(dòng)相。故實(shí)驗(yàn)中考察了上述流動(dòng)相條件，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%乙酸水的色譜峰分離度及峰形相對(duì)較好，對(duì)洗脫條件進(jìn)一步優(yōu)化，最終選擇乙腈-0.5%乙酸水梯度洗脫。

課題組前期對(duì)藍(lán)花參提取條件進(jìn)行考察，考察內(nèi)容包括乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比3個(gè)參數(shù)，結(jié)果顯示：用40%乙醇在料液比為1∶25的條件下超聲30min，藍(lán)花參中化學(xué)成分提取效果最優(yōu)，所以本文對(duì)藍(lán)花參提取采用該參數(shù)進(jìn)行供試品溶液制備。

查閱文獻(xiàn)可知，部分中藥材的黃酮類成分具有止咳化痰的作用[18-21]，與藍(lán)花參的用法功效不謀而合，課題的前期藥理學(xué)研究也說(shuō)明藍(lán)花參在止咳化痰方面具有良好效果[22]，在本次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，下一步擬探討已知化學(xué)成分與藥效之間關(guān)系，為闡明藍(lán)花參止咳化痰藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定依據(jù)。

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