自噬參與糖尿病血管病變的研究進(jìn)展

魏海軍張 鋮楊舒涵鄭 楊申嘉陵劉 勇何延政孫曉磊*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血管外科,四川 瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學(xué)心血管研究所,四川 瀘州 646000;3.四川省衛(wèi)生健康委員會(huì),成都 610041)

自噬(autophagy)是真核生物特有的一種分解代謝過程,在各種細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外刺激條件下,細(xì)胞質(zhì)中受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器被雙層囊泡膜結(jié)構(gòu)包裹后,與溶酶體融合,使得囊泡內(nèi)容物降解以供細(xì)胞再利用。近年來,關(guān)于糖尿病血管損傷的病理生理機(jī)制有較多研究,其中高糖環(huán)境是導(dǎo)致糖尿病血管損傷的關(guān)鍵因素之一。而自噬作為一種機(jī)體的防御機(jī)制,在糖尿病血管損傷中發(fā)揮的作用不可小視。

1 自噬

1.1 自噬概述及其相關(guān)分子

自噬的過程包括:分隔膜、吞噬泡的形成,溶酶體與吞噬泡的融合,內(nèi)容物的降解與釋放等過程。自噬的生理功能主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:(1)胞內(nèi)蛋白可通過自噬被降解,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器的更新和轉(zhuǎn)化,從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1];(2)由自噬產(chǎn)生的降解產(chǎn)物可被機(jī)體循環(huán)再利用以提供能量[2];(3)自噬作為一種防御機(jī)制,能在外界不良刺激和應(yīng)激條件下產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng),保護(hù)受損的組織或細(xì)胞。但是,當(dāng)自噬被過度激活時(shí),又可作為一種程序性死亡調(diào)控程序,調(diào)控細(xì)胞的死亡[2]。自噬主要以三種不同的形式存在:巨自噬,微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬[3-4],所有這些都促進(jìn)溶酶體中細(xì)胞溶質(zhì)的蛋白水解降解。巨自噬和微觀自噬都能夠通過選擇性和非選擇性機(jī)制吞噬大型結(jié)構(gòu)分子。在伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬(CMA)中,靶向蛋白與伴侶蛋白(例如Hsc-70)形成復(fù)合物,穿過溶酶體膜,該蛋白被溶酶體膜受體溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(LAMP-2A)識(shí)別,從而導(dǎo)致蛋白的變性和退化。

自噬相關(guān)基因(autophagy related gene,Atg)負(fù)責(zé)調(diào)控自噬的過程,它的基因片段在進(jìn)化上相對(duì)保守。自噬的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜,它包含Atg及其所編碼的蛋白產(chǎn)物參與自噬的誘導(dǎo),分隔膜的形成,自噬體的產(chǎn)生、成熟等過程。ULK1復(fù)合物(ULK1、FIP200、Atg13)是連接上游刺激信號(hào)與下游自噬體形成的橋梁,能接收上游各種信號(hào)刺激并做出應(yīng)答[5],從而誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生。而PI3K復(fù)合物(Atg6/Beclin-1、Atg14、Vps34/PI3KC3、Vps15)可介導(dǎo)分隔膜的產(chǎn)生[6]。另外,Atg12的結(jié)合過程與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)的修飾過程,這兩個(gè)泛素化過程在自噬體的延伸階段發(fā)揮著重要作用[7]。LC3是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞酵母菌Atg8編碼產(chǎn)生的一種自噬相關(guān)蛋白,被認(rèn)為是一種自噬標(biāo)志分子。前體LC3合成之后,被水解切割掉特異片段后,形成LC3I。LC3I又在Atg7和Atg12-Atg5-Atg16 L的作用下,轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3II,始終結(jié)合于自噬體膜上,所以LC3II的含量也可以反映自噬體的數(shù)量。Beclin-1是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞酵母菌Atg6編碼產(chǎn)生的一種自噬相關(guān)蛋白[8],可介導(dǎo)自噬蛋白定位于吞噬泡,繼而調(diào)控自噬體的形成與成熟,其表達(dá)量的多少亦可反應(yīng)自噬活性的強(qiáng)弱。

1.2 糖尿病狀態(tài)下自噬調(diào)控的分子機(jī)制

目前的研究中,糖尿病通過以下通路影響細(xì)胞的自噬:氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)、mTOR依賴性信號(hào)通路、AMPK途徑等。

2型糖尿病的特征是高血糖和高胰島素血癥,通常伴有糖原和脂質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)蓄積。糖基化和脂肪酸中間體的積累破壞了線粒體和過氧化物酶體的穩(wěn)定性,導(dǎo)致產(chǎn)生活性氧[9]。并且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過量也會(huì)促進(jìn)未折疊蛋白和潛在毒性脂質(zhì)池的形成,從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10-11]。自噬通過去除部分去極化的線粒體,將ROS水平維持在一定的水平,另一方面,ROS可以通過抑制mTOR、增加Beclin-1的表達(dá)、LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化激活自噬[12-15]。此外,ROS可以作為激活JNK-1的信號(hào)分子[16],大量的ROS導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放使線粒體膜電位的破壞,從而導(dǎo)致PINK1/parkin介導(dǎo)的自噬發(fā)生[17-19],ROS還可以通過轉(zhuǎn)錄水平(在細(xì)胞核中)和翻譯水平(在細(xì)胞質(zhì)中)調(diào)節(jié)來誘導(dǎo)自噬過程[20],ROS升高分別激活轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α、p53、FOXO3、Nrf2,促進(jìn)BNIP3、NIX、TIGAR、LC3和p62的轉(zhuǎn)錄[21]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過UPR途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)來誘導(dǎo)自噬[22]。UPR的三個(gè)途徑:(a)PERK通路——它的激活導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子4(transcription factor 4,ATF4)的翻譯[23],(b)IRE1α通路——激活c-Jun-N-terminal激酶(JNK途徑[24]和通過移碼突變的方式修飾x-box結(jié)合蛋白1(x-box binding protein 1,XBP1)的mRNA[25],(c)ATF6通路——調(diào)節(jié)其他UPR成員包括XBP1[26]。PERK通路通過ATF4誘導(dǎo)ATG5、ATG7、ATG10等自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄從而影響自噬[27]。PERK通路也促進(jìn)了聚谷氨酰胺72(polyglutamine 72,PolyQ72)誘導(dǎo)LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化過程[28]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的早期階段,激活的IRE1α通過JUK途徑磷酸化參與誘導(dǎo)自噬過程的Bcl-2,從而導(dǎo)致Bcl-2從Beclin-1分離出來[29]。此外,XBP-1—IRE1α途徑的另一個(gè)參與者,也會(huì)促進(jìn)Beclin-1轉(zhuǎn)錄。ATF6通過誘導(dǎo)XBP-1的轉(zhuǎn)錄間接參與自噬過程[22]。ER應(yīng)激下,過度的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中通過3個(gè)不同的機(jī)制誘導(dǎo)自噬:(a)刺激依賴CamKK/AMPK途徑導(dǎo)致mTOR抑制[30],(b)激活的壞死相關(guān)蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)通過參與磷酸化Beclin-1[31],(c)激活PKC途徑從而導(dǎo)致Bcl2-Beclin-1復(fù)合體分離。

高血糖可激活mTOR信號(hào)通路減輕細(xì)胞自噬。mTOR的機(jī)制靶標(biāo)是經(jīng)典的營(yíng)養(yǎng)途徑,通過與兩種不同的蛋白復(fù)合物mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)結(jié)合來調(diào)節(jié)自噬活性。其中,mTORC1通過直接磷酸化抑制Ulk1復(fù)合物的活性,從而抑制自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin-1的表達(dá)[32-33]。mTORC1在高血糖情況下被很大程度的激活[34]。通過特異性地敲低相關(guān)基因或者使用雷帕霉素(mTOR的抑制劑)抑制mTORC1的表達(dá),可以促進(jìn)自噬的恢復(fù)可以減輕糖尿病對(duì)細(xì)胞的產(chǎn)生的不利影響[35]。

AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是一種營(yíng)養(yǎng)敏感的激酶,在葡萄糖不足的情況下,AMPK通過Ser317和Ser777的磷酸化直接激活ULK1,從而促進(jìn)自噬。相反,高葡萄糖下的mTOR或AKT活性增強(qiáng)導(dǎo)致Ser757處的ULK1磷酸化,抑制ULK1活化,從而破壞ULK1和AMPK之間的相互作用,并減少AMPK下游信號(hào)通路的自噬誘導(dǎo)作用[32]。AMPK的激活還可以在Beclin-1與BCL-2分離后刺激JNK1形成VPS34蛋白復(fù)合物17,并激活自噬[36]。其他研究也報(bào)道,AMPK調(diào)節(jié)FoxO轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),從而誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因的表達(dá)[37]。

2 自噬參與糖尿病相關(guān)血管病變

2.1 微血管病變

2.1.1 自噬在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是一種糖尿病微血管并發(fā)癥,占致失明原因的5%,其組織學(xué)特征包括血-視網(wǎng)膜屏障破裂、新生血管形成、毛細(xì)血管無灌注、周細(xì)胞脫落、內(nèi)皮細(xì)胞減少和纖維血管增生異常。研究表明,毛細(xì)血管閉塞和毛細(xì)血管通透性的增加將破壞血-視網(wǎng)膜屏障,是產(chǎn)生血管滲漏的主要原因,而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)既可促進(jìn)血管滲漏,又可導(dǎo)致新生血管生成,在DR中扮演了重要的角色。近幾年的研究中表明,自噬在糖尿病視網(wǎng)膜病變的新生血管的形成以及血管滲漏中起著重要的作用,而自噬可以調(diào)節(jié)VEGF的分泌從而減輕相應(yīng)的病變。

高糖環(huán)境可以使細(xì)胞中的ROS水平增高,導(dǎo)致炎癥反應(yīng),從而使釋放TNF-α、IL-1β、IL-17A、IL-8和IL-6,在這些炎癥介質(zhì)水平的升高的同時(shí),VEGF連同其可溶性受體sIL-2R的表達(dá)也相應(yīng)增加,VEGF的升高促進(jìn)新生血管的形成使DR進(jìn)一步加重[38]。Müller細(xì)胞是糖尿病視網(wǎng)膜病變中分泌VEGF較多的細(xì)胞之一,研究發(fā)現(xiàn)高糖水平可以促進(jìn)Müller細(xì)胞中的自噬標(biāo)記物升高,但是p62/SQTSM1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平也持續(xù)升高,其結(jié)果導(dǎo)致溶酶體功能失調(diào)使得自噬功能障礙而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡,VEGF的釋放增加[39];通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制p62/SQTSM1的表達(dá)以及mTOR的抑制劑Rapamycin,激活cathepsin L的活性使溶酶體水解活性增強(qiáng),導(dǎo)致自噬體降解,使細(xì)胞的自噬功能恢復(fù)從而抑制VEGF的分泌。與此類似的研究也說明[40],高糖導(dǎo)致的p62/SQTSM1的表達(dá)升高,可以被三七皂苷(notoginsenoside R1,NGR1)通過PINK1依賴的線粒體自噬途徑抑制,降低Müller細(xì)胞中的ROS水平以及炎癥反應(yīng),從而降低VEGF的表達(dá);NGR1上調(diào)了HG誘導(dǎo)的rMC-1細(xì)胞和db/db小鼠視網(wǎng)膜中PINK1和Parkin的水平,增加了LC3II/LC3I的比例,并下調(diào)了p62/SQSTM1的水平,從而減少細(xì)胞中的ROS水平以及炎癥反應(yīng),降低VEGF的表達(dá)。

高血糖除了可以直接影響p62/SQTSM1的表達(dá)以外,還可以損傷血-視屏障導(dǎo)致低密度脂蛋白(LDL)從血管中滲出。經(jīng)過氧化以及糖基化修飾后的低密度脂蛋白(HOG-LDL)在早期的DR中有很強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)作用。然而在這個(gè)過程中,誘發(fā)的自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)死亡以及VEGF的分泌,導(dǎo)致新生血管形成從而加重糖尿病視網(wǎng)膜病變。研究發(fā)現(xiàn)Müller細(xì)胞經(jīng)過HOG-LDL刺激后使AMPK激活導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白ATG-5、Beclin-1、LC3II/LC3I蛋白水平明顯升高,與此同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)也進(jìn)一步升高說明自噬的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[41]。他們的研究中使用芐基四羥基喹啉(benzyltetrahydroxyquinoline,berberine)可以抑制AMPK的激活減輕細(xì)胞中HOG-LDL導(dǎo)致的自噬性細(xì)胞死亡、炎癥反應(yīng)以及血管新生等。近幾年的一些研究通過高糖培養(yǎng)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(retinal endothelial cells,RECs)來建立糖尿病視網(wǎng)膜的血管新生病變的體外模型來進(jìn)一步探尋DR的內(nèi)在機(jī)制。Mao等[42]研究提示去乙?；?(Sirtuin 3,Sir3)可以抑制HRECs中遷移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、血管新生因子VEGF、HIF-1a、和IGF-1的表達(dá),而且研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Sir3可以促進(jìn)LC3I以及LC3II的表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞自噬,并且細(xì)胞自噬后期可以降低VEGF、HIF-1α的表達(dá),故Sir3可能通過自噬來抑制HRECs的血管新生。Mao等[43]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中和體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-204-5p可以促進(jìn)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的血管新生,其中LC3II以及LC3I/LC3II的表達(dá)降低,說明通過降低miR-204-5p的表達(dá)可以促進(jìn)LC3II的表達(dá)從而減低VEGF的分泌。

綜上所述,自噬在糖尿病視網(wǎng)膜病變中在多個(gè)細(xì)胞中起著調(diào)節(jié)作用,目前大部分的研究肯定了自噬在DR中的保護(hù)作用,但是在某些情況,過度自噬也將會(huì)導(dǎo)致DR進(jìn)一步惡化[41],這兩種作用的相互聯(lián)系尚需進(jìn)一步研究闡明。

2.1.2 自噬在糖尿病腎病中的作用

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,目前已成為繼腎小球腎炎后終末期腎病的第2位原因,DN的一個(gè)重要臨床特征是尿蛋白。在蛋白尿的糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)腎小球?yàn)V過屏障的結(jié)構(gòu)改變,包括腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷[44-45]。近來有越來越多的證據(jù)表明,腎小球血管周圍的足細(xì)胞自噬水平對(duì)糖尿病腎病發(fā)展有重要的作用。在不同類型的細(xì)胞中,自噬發(fā)揮的作用也有所不同:

(1)足細(xì)胞 足細(xì)胞損傷是DN中關(guān)鍵因子,可以作為DN演變的臨床預(yù)測(cè)指標(biāo)。在高糖的反復(fù)刺激下,維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)對(duì)于足細(xì)胞的命運(yùn)極為重要[46]。近幾年的研究中發(fā)現(xiàn),自噬可以維持足細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),從而改善糖尿病腎病。研究發(fā)現(xiàn),相當(dāng)一部分腎保護(hù)藥物是通過mTOR/AMPK途徑促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白如LC3II、Beclin-1等的表達(dá),增強(qiáng)自噬形成,從而對(duì)足細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[47-53]。Liu等[54]研究發(fā)現(xiàn),在高血糖下,足細(xì)胞中β-arrestin-1和β-arrestin-2的表達(dá)水平增高,而且β-arrestin-1和β-arrestin-2可以通過抑制ATG12-ATG5的結(jié)合來抑制足細(xì)胞自噬,導(dǎo)致腎的損傷,這可能成為治療糖尿病腎病新的靶點(diǎn)。

既往的研究顯示,在糖尿病腎病的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的病理現(xiàn)象。EMT是一個(gè)動(dòng)態(tài)的發(fā)展過程,其特征在于上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞(如成肌纖維細(xì)胞)的特征,這會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)記物(如E-鈣黏著蛋白)表達(dá)降低,間充質(zhì)標(biāo)記物(如α-SMA和纖連蛋白)的表達(dá)增強(qiáng),從而破壞腎小管基底膜以及增強(qiáng)足細(xì)胞的遷移[55]。Jin等[56]發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)下,足細(xì)胞中STIM1激活TRPC6和Orai1通道,使鈣離子通道打開,導(dǎo)致p62表達(dá)增高和LC3II/LC3I降低從而抑制自噬,最終加速了EMT的發(fā)生。Jin等[57]在進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn),HMGB1通過激活A(yù)KT/mTOR通路抑制LC3II的表達(dá)和促進(jìn)p62的升高,從而導(dǎo)致足細(xì)胞的EMT的增強(qiáng)。這些研究說明,自噬抑制足細(xì)胞的EMT,從而抑制糖尿病腎病的進(jìn)展。

(2)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 Lenoir等[58]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬與糖尿病腎病之間相關(guān)的直接證據(jù)。他們研究顯示,內(nèi)皮細(xì)胞特異性自噬缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的腎小球損傷,表明內(nèi)皮細(xì)胞自噬對(duì)糖尿病所引起的應(yīng)激起著重要的保護(hù)作用;并且內(nèi)皮細(xì)胞特異性自噬缺陷小鼠模型可提供足細(xì)胞和近端腎小管細(xì)胞以外的其他腎細(xì)胞中糖尿病腎病自噬的重要信息。晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)和AGEs受體(RAGE)被證明在糖尿病性腎病中起重要作用。Hou等[59]研究表明丹酚酸A(salvianolic acid A,SalA)通過AGE-RAGE-Nox4軸減弱了AGEs誘導(dǎo)的ROS,從而促進(jìn)Atg5、Atg7、Atg12、LC3II/LC3I的表達(dá)以及抑制p62的表達(dá),從而恢復(fù)高糖導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞自噬紊亂,抑制DN的進(jìn)程。Lim等[60]的研究表明,西那卡塞(Cinacalcet)通過CaMKKβ-LKB1-AMPK軸促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中LC3II/LC3I、Beclin-1的表達(dá),從而減輕高糖對(duì)腎小球的損傷。這些研究證明,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中自噬的激活對(duì)腎臟功能起著保護(hù)作用。

2.2 外周血管病變

2.2.1 自噬在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化性病變中的作用

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心腦血管疾病以及下肢動(dòng)脈硬化的主要原因,它是以脂質(zhì)蓄積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的慢性炎癥性過程。在糖尿病導(dǎo)致的動(dòng)脈硬化疾病中,自噬起著調(diào)節(jié)作用。Tian等[61]的研究發(fā)現(xiàn),高糖激活mTOR信號(hào)通路抑制LC3II/LC3I以及Beclin-1的表達(dá)以及增加SQSTM1/p62堆積抑制自噬,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白如p-JNK、CHOP和Caspase-12表達(dá)升高,誘導(dǎo)凋亡,從而促進(jìn)鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。Tian等[62]的研究發(fā)現(xiàn),糖尿病狀態(tài)下,糖化高密度脂蛋白引起巨噬細(xì)胞的凋亡并伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活化—包括核轉(zhuǎn)位激活轉(zhuǎn)錄因子6、蛋白激酶樣ER激酶(PERK)的磷酸化和真核生物翻譯起始因子2以及C/EPB同源蛋白的上調(diào),通過加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)可以抑制上述過程,從而抑制巨噬細(xì)胞的凋亡;而加入自噬的抑制劑3-MA或抑制Beclin-1表達(dá)可以促進(jìn)這一過程,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的凋亡,從而促進(jìn)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的進(jìn)展。Lazaro等[63]的實(shí)驗(yàn)也證明核樣因子2(nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2)可以通過促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3II/LC3I的表達(dá)升高,SQSTM1表達(dá)的降低來抑制血管壁的炎癥相關(guān)水平,使糖尿病導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化向好的方向發(fā)展。

動(dòng)脈粥樣硬化的始發(fā)事件是血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[8]。高血糖可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平上升,從而導(dǎo)致炎癥,內(nèi)皮細(xì)胞的損傷最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Xie等[64]的研究中發(fā)現(xiàn),AGEs可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞中的活性氧水平升高,作為一種防御機(jī)制,機(jī)體內(nèi)的自噬水平相應(yīng)的增加,而且自噬相關(guān)的抑制劑3-MA加重了AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。Fetterman等[65]研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中,自噬可以激活一氧化氮合酶(eNOS);通過從糖尿病病人以及正常人中收集內(nèi)皮細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),相比于正常人來講,糖尿病病人內(nèi)皮細(xì)胞的p62水平明顯升高,標(biāo)志著自噬通量降低。雖然糖尿病組與正常組的LC3以及Beclin-1水平相似,但是在糖尿病組中的自噬終末期的標(biāo)志物溶酶體蛋白Lamp2a的水平明顯升高,通過抑制終末期的自噬,使自噬長(zhǎng)期處于活躍水平導(dǎo)致eNOS激活,從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。Bai等[66]的研究中提出高血糖導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的新機(jī)制,他們的研究指出內(nèi)皮細(xì)胞中的小窩蛋白1(caveolin-1,CAV1)具有介導(dǎo)脂質(zhì)大分子物質(zhì)胞吞的作用,它有兩種類型的LC3相互作用區(qū)(LC3-interacting region,LIR):CAV1支架結(jié)構(gòu)域(the CAV1 scaffolding domain,CSD)和膜內(nèi)結(jié)構(gòu)域(intramembrane domain,IMD)。CAV1可 以 與CAVIN1-LC3B結(jié)合并形成復(fù)合物。由于小窩相關(guān)蛋白1(caveolae associated protein 1,CAVIN1)沒有LC3結(jié)合片段,而CAV1具有超過2個(gè)LIR,所以CAV1作為CAVIN1和LC3B之間的中間連接體可以介導(dǎo)自噬抑制。當(dāng)CAV1作為結(jié)構(gòu)蛋白存在于膜小窩或小窩中以介導(dǎo)LDL轉(zhuǎn)胞作用時(shí),IMD中的LIR被掩埋,CAV1僅對(duì)通過CSD的自噬發(fā)揮抑制作用。當(dāng)CAV1存在于細(xì)胞質(zhì)中時(shí),CAV1通過IMD可能有機(jī)會(huì)與LC3B結(jié)合并介導(dǎo)CAV1的自噬降解。在正常的葡萄糖環(huán)境下,CAV1在細(xì)胞質(zhì)中的自噬降解和利用CAV1形成膜小泡保持了一定的穩(wěn)態(tài),并且在內(nèi)皮細(xì)胞膜中小泡的形成相對(duì)較少,因此內(nèi)吞小窩對(duì)LDL的胞吞作用也維持在相對(duì)較低的水平。通過抑制AMPK-mTOR-PIK3C3途徑,高葡萄糖抑制了CAV1-CAVIN1-LC3B介導(dǎo)的CAV1自噬降解。結(jié)果,更多的CAV1積累在細(xì)胞質(zhì)中,在細(xì)胞膜中形成更多的小孔并促進(jìn)LDL跨內(nèi)皮細(xì)胞的胞吞作用,從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)在內(nèi)皮下的滯留,這個(gè)機(jī)制或許可為糖尿病導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化提供新的治療方案。

與此同時(shí),其他的一些研究也發(fā)現(xiàn)自噬在內(nèi)皮功能保護(hù)中的不利作用。Cai等[67]的研究發(fā)現(xiàn),與正常組比較,高糖組自噬相關(guān)蛋白Atg7、LC3II/LC3I的水平明顯升高,而且這個(gè)過程中凋亡相關(guān)蛋白Bax、BCL-2蛋白水平也明顯升高,說明高糖可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的自噬性死亡,而GLP-1高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)通過GLP-1RERK1/2依賴性通路,恢復(fù)HDAC6活性,抑制高糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和過度自噬性死亡,提示自噬在內(nèi)皮細(xì)胞中有害的一面。除此之外,Qiu等[68]發(fā)現(xiàn),高糖降低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)硫化氫的水平,激活A(yù)MPK/mTOR通路導(dǎo)致LC3II/LC3I、Beclin-1的水平升高以及P62降低,而這個(gè)自噬增強(qiáng)的過程可以導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞的功能紊亂,也提示了自噬在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化過程中的不利作用。

2.2.2 自噬在糖尿病血栓形成以及瘤樣擴(kuò)張狀態(tài)中的作用

大約65%的糖尿病患者死于血栓性事件,包括心臟病發(fā)作和中風(fēng)[69]。其中大約40%～60%的糖尿病病人對(duì)抗血栓藥物阿司匹林耐受[70],進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病病人血液中血小板被顯著激活[71]。Lee等[71]研究發(fā)現(xiàn),高糖可以導(dǎo)致血小板內(nèi)的ROS水平升高,pp53的激活,線粒體功能紊亂,導(dǎo)致血小板的凋亡從而形成血栓;而激活線粒體自噬可以維持線粒體功能抑,制血小板的功能紊亂,從而抑制血栓的形成。Paul等[72]通過饑餓的方式抑制血小板的聚集,自噬相關(guān)的因子Atg3、Atg5、Atg7、Atg12、Atg16、Beclin-1、LC3II/I明顯上升,加入自噬抑制劑3-MA可以恢復(fù)血小板的聚集,進(jìn)一步證實(shí)了自噬在血小板的聚集中的有利的作用。

主動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞的減少導(dǎo)致中膜薄弱可以導(dǎo)致動(dòng)脈瘤的形成,糖尿病狀態(tài)下,腹主動(dòng)脈瘤與胸主動(dòng)脈瘤的發(fā)病率明顯降低[73]。Zheng等[74]發(fā)現(xiàn),腹主動(dòng)脈瘤患者組織中自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子TG4b、Atg6/Beclin-1,Bnip3和Vps34等表達(dá)升高,伴隨整合素/CD44的激活和p38/MAPK信號(hào)通路的增強(qiáng),同時(shí),LC3蛋白表達(dá)水平且LC3II/I值也相應(yīng)增高。另外,Giusti等[75]通過微陣列分析技術(shù)對(duì)腹主動(dòng)脈瘤患者和正常人的外周血進(jìn)行基因表達(dá)譜差異分析,發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因Atg5表達(dá)上調(diào)。因此,腹主動(dòng)脈瘤患者中自噬水平的升高很可能與機(jī)體自身的防御抵抗機(jī)制密切相關(guān)。近來又有研究發(fā)現(xiàn),RAPA可極大地延緩腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病進(jìn)程,但RAPA同時(shí)也是一種炎癥抑制劑,故不能完全確定RAPA是否通過激活自噬而減輕腹主動(dòng)脈瘤的進(jìn)展[76]。這些研究都證實(shí)自噬和高血糖可能參與腹主動(dòng)脈瘤的病理過程,但目前尚沒有更多研究闡明自噬、糖尿病以及動(dòng)脈瘤之間相互關(guān)系。

上述研究結(jié)果顯示,雖然自噬相關(guān)基因在糖尿病外周血管病變中上調(diào),但自噬在糖尿病外周血管病變發(fā)病機(jī)制中的具體機(jī)制仍未闡明。體外實(shí)驗(yàn)中,許多糖尿病外周血管病變相關(guān)因子可以激活自噬而發(fā)揮保護(hù)性作用,且此保護(hù)作用是通過減弱氧化應(yīng)激和炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而起效;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,越來越多的證據(jù)表明自噬在動(dòng)脈粥樣硬化中起保護(hù)作用,且可維持動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。其中,RAPA減輕糖尿病外周血管病變的機(jī)制尚不清楚,但其為激活自噬治療糖尿病外周血管病變提供了新的方向。

3 結(jié)語與展望

作為機(jī)體的防御機(jī)制和蛋白質(zhì)降解的重要途徑,自噬在糖尿病血管病變中的作用正在漸漸被探索、挖掘。本文綜述了自噬分別在糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病外周血管病變、糖尿病心腦血管病變中的作用,并對(duì)自噬參與糖尿病血管病變的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了深入探討(圖1)。就目前的研究趨勢(shì)來看,通過使用自噬激活劑和抑制劑來調(diào)控自噬的水平已經(jīng)成為了學(xué)者們的慣用思路,當(dāng)然,過表達(dá)特定自噬相關(guān)基因或使其被敲除也是目前常用的研究方法。但是大多數(shù)研究都是從細(xì)胞水平出發(fā)探究自噬在相關(guān)病理狀態(tài)下的作用,也使得其后續(xù)的功能檢測(cè)方法受限,因而建議從整體水平更加全面地探究自噬在糖尿病血管病變中的作用。并且,自噬在某些糖尿病血管病變中的病理生理作用仍未闡述清楚,部分結(jié)論仍有爭(zhēng)議,所以未來仍需深入研究。糖尿病血管病變的病理生理學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜,因此找尋其發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因子或重要的信號(hào)通路就顯得尤為重要,通過自噬篩選的相應(yīng)靶點(diǎn)可以作為治療糖尿病血管病變的新途徑。雖然目前自噬在糖尿病血管病變中的發(fā)生機(jī)制仍未闡明,但相信隨著研究的不斷深入,靶向自噬的機(jī)制研究一定會(huì)為糖尿病血管病變的治療開創(chuàng)新局面。

圖1 糖尿病狀態(tài)下自噬調(diào)節(jié)的信號(hào)通路Figure 1 Signal pathways regulating autophagy in diabetes