正交試驗(yàn)優(yōu)化加楊樹(shù)皮中總酚酸的提取工藝

王 碧，嚴(yán) 奇，趙友誼，王 鳴，劉 飛，廖盼華，王奇志*

(1.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所江蘇省植物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014；2. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京210014)

加拿大楊(PopuluscanadensisMoench)，又名加楊，是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)多年生落葉大喬木，分布廣泛，我國(guó)除廣東、云南、西藏外，其余省區(qū)均有栽培；枝葉茂密，樹(shù)干高大通直，適應(yīng)性強(qiáng)，能夠在干旱和鹽堿地栽培，是用材林、行道樹(shù)和防護(hù)林的優(yōu)良樹(shù)種[1]。楊樹(shù)周身是寶，除被用作木材外，還具有抗氧化、抗腫瘤、抗?jié)?、抗微生物、抗炎、?zhèn)痛等功效[2-4]；其中含有大量的酚酸類化合物，能有效降低高血壓、癌癥和糖尿病的發(fā)生率。此外，楊樹(shù)皮中還含有白楊素、高良姜素-3-甲氧基、喬松素、槲皮素-3,7-二甲氧基、鼠李素、山柰酚-3-甲氧基、芹菜素等黃酮類化合物[5]，對(duì)心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有作用[6]。白楊素具有抗腫瘤、放療增敏、抑制芳香酶活性、抗炎、抗氧化、防治心腦血管疾病等多種藥理作用[7]，也是合成抗菌、抗癌、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等藥物的原料[8-11]。

楊樹(shù)皮化學(xué)成分的傳統(tǒng)提取分離方法主要是用熱水提取，或是水提液的乙酸乙酯萃取部位加入過(guò)量的堿式醋酸鉛后，分為沉淀和水溶液兩部分，沉淀脫鉛后和水溶液分別用聚酰胺柱層析法或逆流分配法進(jìn)行分離。然而，這些方法需用酸堿處理，環(huán)境污染大；其次，堿性環(huán)境易引起苯甲?；D(zhuǎn)移；并且用與不用鉛鹽處理而分離得到的成分也大致相同。此外，楊樹(shù)皮還含有豐富的低極性活性類脂類成分，如不飽和甾醇、維生素E、磷脂等[12]，具有很高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，傳統(tǒng)提取方法導(dǎo)致其低極性部位流失，資源得不到充分利用。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、環(huán)保的經(jīng)石油醚冷浸脫脂后的楊樹(shù)皮總酚酸的提取方法具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以總酚酸的含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法篩選楊樹(shù)皮總酚酸的最佳提取工藝，為加楊資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 材料

加拿大楊樹(shù)皮采自南京中山植物園，經(jīng)江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所袁昌齊研究員鑒定為楊柳科植物加拿大楊，粉碎成粗粉，備用。標(biāo)本現(xiàn)存放于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所藥用植物研究開(kāi)發(fā)中心(標(biāo)本編號(hào)：pc20161019)。

1.1.2 儀器

TU-1221型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；石英比色皿(1 cm)；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士Buchi公司)；LIBROR AEL-200型電子天平；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋。

1.1.3 試劑

白楊素對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111701-200501)；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 楊樹(shù)皮總酚酸的提取

精密稱取經(jīng)石油醚冷浸脫脂后的楊樹(shù)皮粉末1 g，三次分別加入4 mL，3 mL及3 mL的60%乙醇，浸泡30 min，加熱回流3次，每次2 h，過(guò)濾，合并濾液，置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度。精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加60%乙醇定容，過(guò)濾，取濾液，即得。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取白楊素對(duì)照品5.000 mg，置50 mL棕色量瓶中，加60%乙醇溶解并定容，得白楊素貯備液(0.1000 mg·mL-1)；精密量取白楊素貯備液適量，用60%乙醇配制成系列濃度的對(duì)照品溶液，即得。

1.2.3 紫外吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

取2 mL對(duì)照品于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，以無(wú)水乙醇為參比液進(jìn)行基線校正，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在 200～800 nm 處掃描。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取白楊素對(duì)照品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，搖勻，于500 nm 處測(cè)定吸光度。以白楊素的濃度(C)為橫坐標(biāo)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=6.6706C+0.0078，R2=0.9993，結(jié)果表明，白楊素在0～0.1002 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液適量，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果平均吸光度為0.342，RSD為0.29%。表明精密度良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液適量，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每隔20 min測(cè)定一次，結(jié)果平均吸光度為0.349，RSD為1.42%。表明樣品溶液顯色后在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取楊樹(shù)皮粉末6份，按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，根據(jù)紫外分光光度法，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果供試品的平均含量為10.40 mg·g-1，RSD為1.82%。表明重復(fù)性試驗(yàn)良好。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的楊樹(shù)皮粉末6份，每份0.05 g，精密稱取，精密加入白楊素貯備液5 mL，按1.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，根據(jù)紫外分光光度法，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行操作6份，結(jié)果平均回收率為100.95%，RSD為2.49%。

1.2.9 樣品的測(cè)定

精密吸取正交試驗(yàn)樣品1～3 mL，加入60%乙醇適當(dāng)稀釋，過(guò)濾，取濾液，即得供試品溶液。取供試品溶液適量，根據(jù)紫外分光光度法，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算楊樹(shù)皮總黃酮及酚酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溶劑濃度的篩選

分別稱取10份楊樹(shù)皮粉末各10 g，置于圓底燒瓶瓶中，分別向其中加入20、30、40、50、60、70、80、90%的乙醇溶液100 mL，浸泡30 min，加熱回流2 h，過(guò)濾，得樣品提取液，按照1.2.9項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，60%乙醇溶液的提取得率最高，故選擇60%乙醇溶液作為提取溶劑，見(jiàn)表1。

表1 溶劑濃度的篩選Table 1 The selection of solvent concentration

2.1.2 回流次數(shù)的篩選

分別稱取5份楊樹(shù)皮粉末各10 g，分別加入60%乙醇溶液100 mL，采用回流法分別提取1、2、3、4、5次，每次2 h，過(guò)濾，得樣品提取液，按照1.2.9項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，總酚酸得率與回流次數(shù)呈正相關(guān)；當(dāng)回流次數(shù)達(dá)到3時(shí)，總酚酸得率與液料比無(wú)關(guān)，幾乎為一定值。從節(jié)約能源的角度考慮，故選擇回流次數(shù)為3，見(jiàn)表2。

表2 回流次數(shù)的篩選Table 2 The selection of reflux times

2.1.3 回流時(shí)間的篩選

他喜歡把我介紹給他的朋友們，摟著我親昵地對(duì)他們說(shuō)，你好，這是林林。他的朋友們也見(jiàn)怪不怪，男人嘛，對(duì)待這種事情，總是心照不宣。酒會(huì)啊，舞會(huì)啊，生日晚宴什么的，他都帶我參加，仿佛我就是他的正牌妻子。

分別稱取6份楊樹(shù)皮粉末各10 g，分別加入60%乙醇溶液100 mL，采用回流法分別提取1、2、3、4、5 h，過(guò)濾，得樣品提取液，按照1.2.9項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，總酚酸得率與回流時(shí)間呈正相關(guān)；當(dāng)回流時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，總酚酸得率與液料比無(wú)關(guān)，幾乎為一定值。從節(jié)約能源的角度考慮，故選擇回流時(shí)間為2 h，見(jiàn)表3。

表3 回流時(shí)間的篩選Table 3 The selection of reflux time

2.1.4 液料比的篩選

分別稱取2份楊樹(shù)皮粉末各10 g，分別以料液比為3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1及30∶1的60%乙醇溶液回流提取，過(guò)濾，得樣品提取液，按照1.2.9項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，總酚酸得率與液料比呈正相關(guān)；當(dāng)液料比達(dá)到10∶1時(shí)，總酚酸得率與液料比無(wú)關(guān)，幾乎為一定值。從節(jié)省溶劑角度考慮，故選擇液料比為10:1，見(jiàn)表4。

表4 料液比的篩選Table 4 The selection ofthe liquid-solid ratio

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為全面考察影響因素，基于前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響提取效果的主要因素設(shè)計(jì)了4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn)，按照1.2.9項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行含量測(cè)定，以白楊素提取率為指標(biāo)，對(duì)最佳提取條件進(jìn)行研究，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表5、試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6、方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表5 正交試驗(yàn)因素與水平Table 5 The factors oforthogonal experimental design

2.3 正交樣品溶液的制備

分別稱取楊樹(shù)皮粉末10 g，按照L9(34)正交試驗(yàn)表提取樣品，加相應(yīng)提取溶媒定容至一定體積，即得正交樣品溶液。

2.4正交試驗(yàn)方法及結(jié)果

用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)研究，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，并對(duì)總黃酮及酚酸的含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7能夠直觀地看出，以總酚酸含量為考察指標(biāo)，影響含量的因素依次為A>D>B>C，即乙醇濃度的影響最高，其余依次是液料比、回流次數(shù)，影響最小的是回流提取時(shí)間。根據(jù)方差分析結(jié)果可知，A因素對(duì)提取的影響有顯著性差異，B和D因素對(duì)提取的影響無(wú)顯著性差異。根據(jù)表6各因素k的變化，A2>A3>A1，B3>B2>B1，C2>C3>C1，D2>D3>D1，得出A、C和D因素應(yīng)選擇水平2，B因素應(yīng)選擇水平3，即A2B3C2D2。最終確定楊樹(shù)皮總酚酸的最佳提取工藝條件為：A2B3C2D2，即使用60%乙醇回流提取3次，每次2 h，液料比為10∶1。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 6 The results andanalysis of orthogonal experimental design

表7 方差分析結(jié)果Table 7 The results ofanalysis of variance

2.5 最佳提取工藝條件的驗(yàn)證

按照上述最佳提取條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表8。由驗(yàn)證結(jié)果可知，按最佳工藝條件提取得到的總酚酸提取率均高于其它各正交試驗(yàn)值，三份樣品總酚酸的平均提取率為28.34%，RSD為1.37%。說(shuō)明該工藝穩(wěn)定、可靠，達(dá)到了提取條件優(yōu)化的目的。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 8 The results of verification tests

3 結(jié)論與討論

3.1 本試驗(yàn)采用紫外分光光度法，在200～ 800 nm范圍內(nèi)對(duì)白楊素對(duì)照品溶液及供試品溶液進(jìn)行掃描，于500 nm處測(cè)定吸光度，操作簡(jiǎn)單，干擾少，測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。

3.2 楊樹(shù)皮的主要成分是酚酸類化合物，以白楊素的含量為考察指標(biāo)進(jìn)行了L9(34)正交試驗(yàn)，確定了最佳提取工藝條件為：以60%乙醇為溶媒，提取3次，每次2 h，總液料比為10∶1。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該提取工藝穩(wěn)定可行，適用于加拿大楊的工業(yè)化提取。

3.3 綜上所述，對(duì)于經(jīng)石油醚冷浸脫脂后的楊樹(shù)皮有效成分的提取可采用較低濃度的乙醇在適當(dāng)?shù)臏囟群突亓鲿r(shí)間下進(jìn)行提取，既避免了用甲醇提取以降低毒性，又提高了提取率。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于加拿大楊樹(shù)皮有效成分的提取達(dá)到了工序短、易操作和成本低的目的，改進(jìn)了加工工藝，為加拿大楊的工業(yè)化加工和生產(chǎn)提供了參考。