實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠微衛(wèi)星DNA檢測法標(biāo)準(zhǔn)的編制

王 洪，魏 杰，馮育芳，付 瑞，王淑菁，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量是決定科研數(shù)據(jù)可重復(fù)性的關(guān)鍵因素，我國目前急需在該領(lǐng)域建立分子生物學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)對實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量的有效控制。結(jié)合實(shí)際工作需求，中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)會提出了小鼠、大鼠微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測方法團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的研究和建立，由中國食品藥品檢定研究院、首都醫(yī)科大學(xué)和浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院共同完成。本文重點(diǎn)介紹了該標(biāo)準(zhǔn)編制的背景和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，旨在強(qiáng)化該團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的宣傳和實(shí)施，促進(jìn)我國實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，為實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量國家標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供依據(jù)。

1 編制背景

實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量控制是實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。生物醫(yī)學(xué)研究中必須使用遺傳背景明確，符合其品系遺傳特征的實(shí)驗(yàn)動物，才能獲得可信的，可重復(fù)的科研數(shù)據(jù)。在我國，實(shí)驗(yàn)動物的遺傳質(zhì)量控制主要應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14927.1-2008中推薦的生化標(biāo)記檢測法，該方法自上世紀(jì)90年代投入使用，一直沿用至今，該方法在實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量控制方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在國際上，越來越多的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記，SNP標(biāo)記等DNA標(biāo)記方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物的遺傳質(zhì)量檢測。在美國，Jackson Lab 采用SNP方法(28個位點(diǎn))作為實(shí)驗(yàn)動物的遺傳質(zhì)量控制手段[1]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 14923-2010 哺乳類實(shí)驗(yàn) 動物的遺傳質(zhì)量控制中也對封閉群實(shí)驗(yàn)動物的遺傳質(zhì)量監(jiān)測提出明確規(guī)定，并推薦使用DNA標(biāo)記方法。

目前，我國實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量控制方面急需解決的問題主要是：①現(xiàn)行的生化標(biāo)記檢測法存在一定的局限性：位點(diǎn)數(shù)量少，位點(diǎn)多態(tài)性低，位點(diǎn)未能實(shí)現(xiàn)全基因組覆蓋，完成檢測需要處死實(shí)驗(yàn)動物；②DNA標(biāo)記方法在我國實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量控制方面的應(yīng)用尚屬空白；③缺少DNA檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)。

微衛(wèi)星DNA是動物基因組中的簡單重復(fù)序列，該重復(fù)序列比小衛(wèi)星DNA短，所以叫作微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)。微衛(wèi)星DNA的核心序列是以二個核苷酸為重復(fù)單位，AC和TG最為多見，核心序列的重復(fù)次數(shù)是可變的，一般為10 ～ 20次左右，這就是微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的基礎(chǔ)。不同個體因?yàn)楹诵男蛄兄貜?fù)次數(shù)的差異，而形成各自特有的遺傳結(jié)構(gòu)。微衛(wèi)星DNA兩端的側(cè)翼序列是相對保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩側(cè)的特異序列合成引物。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)小鼠和實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行遺傳質(zhì)量監(jiān)測，同時開展遺傳組成分析和品系鑒別。在國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14927.1-2008近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測法中，是生化標(biāo)記方法的具體操作內(nèi)容，目前國內(nèi)缺乏DNA標(biāo)記方法相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)參考了我國、美國、日本等國家的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測法[2-7]，本標(biāo)準(zhǔn)的編制可以作為國家標(biāo)準(zhǔn)GB 14927.1-2008的補(bǔ)充。

2 內(nèi)容編制

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇

微衛(wèi)星方法和SNP方法均可用于實(shí)驗(yàn)小鼠和實(shí)驗(yàn)大鼠的遺傳質(zhì)量評價的常用的DNA標(biāo)記方法。SNP方法檢測實(shí)驗(yàn)動物單核苷酸的差異，能夠提供的動物的遺傳背景信息不如微衛(wèi)星方法豐富。微衛(wèi)星方法的優(yōu)點(diǎn)是：數(shù)量多，在基因組中均勻分布；具有豐富的多態(tài)性；操作簡便，重復(fù)性好[8]。本標(biāo)準(zhǔn)中的微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，切合我國國內(nèi)實(shí)際現(xiàn)狀，并可持續(xù)完善。標(biāo)準(zhǔn)中選用的微衛(wèi)星位點(diǎn)經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和優(yōu)化。優(yōu)化原則包括：①選擇多態(tài)性豐富的位點(diǎn)，摒棄在多個品系間無多態(tài)性的位點(diǎn)；②選擇覆蓋實(shí)驗(yàn)小鼠和實(shí)驗(yàn)大鼠的全部染色體的微衛(wèi)星位點(diǎn)，力求全面客觀體現(xiàn)動物品系的遺傳背景；③選擇電泳條帶清晰，界限明確，雜帶少的位點(diǎn)，減少非特異性擴(kuò)增對檢測結(jié)果的影響。該標(biāo)準(zhǔn)中的微衛(wèi)星檢測法經(jīng)過廣東、浙江和北京的三家實(shí)驗(yàn)室對其重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明三家實(shí)驗(yàn)室獲得完全一致的檢測結(jié)果，證明該方法具備可行性和良好的重復(fù)性。通過參加國際實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)理事會(International Council for Laboratory Animal Science，ICLAS)開展的遺傳標(biāo)準(zhǔn)品項(xiàng)目(Genetic Reference Program)，應(yīng)用12個品系近交系小鼠的DNA標(biāo)準(zhǔn)品完成對微衛(wèi)星檢測法的適用性研究。結(jié)果表明，該標(biāo)準(zhǔn)方法是國際通用的實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量評價方法。標(biāo)準(zhǔn)中采用30個小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)用于近交系小鼠的遺傳質(zhì)量檢測和封閉群小鼠的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，具體位點(diǎn)信息見表1。標(biāo)準(zhǔn)中采用6個大鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)用于近交系大鼠的遺傳質(zhì)量檢測，采用25個大鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)用于封閉群大鼠的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，具體位點(diǎn)信息見表2和表3。

2.2 近交系小鼠和近交系大鼠遺傳質(zhì)量評價

近交系實(shí)驗(yàn)動物是指經(jīng)過20代以上連續(xù)全同胞或親子交配，近交系數(shù)達(dá)到98.6%以上的動物群體。近交系動物同一品系中不同個體的遺傳背景完全相同，所有遺傳標(biāo)記都是純合的。近交系小鼠的品系數(shù)量多，每一個品系擁有自身特有的遺傳背景。當(dāng)進(jìn)行近交系小鼠的遺傳質(zhì)量檢測時，應(yīng)根據(jù)檢測目的選取微衛(wèi)星位點(diǎn)，如果僅用于區(qū)別少數(shù)近交系小鼠，可選擇10個微衛(wèi)星位點(diǎn)；如果待檢測近交系品系數(shù)量多，可選擇20個微衛(wèi)星位點(diǎn)。原則上需選取覆蓋小鼠20條染色體的20個微衛(wèi)星位點(diǎn)。參見表4所示7個近交系小鼠品系的遺傳背景。

近交系大鼠的品系數(shù)量較少，用表2中的6個微衛(wèi)星標(biāo)記，可以區(qū)分常見的3個品系的近交系大鼠。

結(jié)果判定：近交系小鼠和近交系大鼠同一品系的所有個體在所有微衛(wèi)星位點(diǎn)均應(yīng)表現(xiàn)為純合，該品系即為遺傳質(zhì)量合格的實(shí)驗(yàn)動物。如果同一品系內(nèi)出現(xiàn)雜合位點(diǎn)，該品系即為遺傳質(zhì)量不合格的實(shí)驗(yàn)動物。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠30個微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增條件和染色體分布

表2 近交系大鼠6個微衛(wèi)星引物序列及常見品系帶型

注：按泳動快慢將條帶按a、b、c依次命名，泳動最快的條帶命名為“a”。

Note. The name of the bands (a, b, c) indicates the band migration speed; the fastest band is named ‘a(chǎn)’.

表3 封閉群大鼠25個微衛(wèi)星位點(diǎn)序列和染色體分布

(續(xù)表3)

位點(diǎn)Locus引物序列(5’→3’)Primer sequences染色體ChromosomeLCATACAGAGCAAGCTCCAGGACTGTTTCTAATCCATAGGAAGTGC13ALBTTTTCGTAGTAACGGAAGCCTAAGGATTCTCAGATGCAAATG14D15Mit3GACCTGACCTGTTGTGGGATGTTGCTCTCTGGCCTCCTC15MBPAACCTACACGGACACATGGTGGTTGTACTTCCTGATTTCCCTTT16ACRMAGGAAATTAAGAGAAGTTGGGACTTATGCTCTTTGGGCAGCTTA17TILPAATCACTGGATGCTGGAAGAAGGGAGCAGAACTACTAAAGATACA18AGTTATGTAACTCAACGCCAGCCTAAGGATTCTCAGATGCAAATG19TNFAGGAAATGGGTTTCAGTTCCCAGGATTCTGTGGCAATCTG20PRPS2GTTTTCCCGCTTCACCAGAGAAGGAGAAAGCGACCGX

表4 常見近交系小鼠在30個微衛(wèi)星位點(diǎn)的片段大小

2.3 封閉群小鼠和封閉群大鼠群體遺傳質(zhì)量評價

不同類型的實(shí)驗(yàn)動物有獨(dú)特的遺傳檢測需求。必須選擇適當(dāng)?shù)倪z傳質(zhì)量檢測方式。與近交系實(shí)驗(yàn)動物不同，封閉群實(shí)驗(yàn)動物同一品系不同個體具有多樣化的基因型，所有遺傳標(biāo)記都是雜合的。對于近交系動物，可以對一個個體進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測；對于封閉群動物，至少應(yīng)采用25只動物進(jìn)行檢測，才能獲得相對準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。而微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇，封閉群小鼠在表1中選擇25個微衛(wèi)星位點(diǎn)，原則上需覆蓋小鼠的20條染色體。封閉群大鼠選取表3中25個微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，原則上需覆蓋大鼠的21條染色體。通過提取DNA，PCR反應(yīng)，電泳和測序獲取檢測數(shù)據(jù)，應(yīng)用軟件POPGEN 1.32和PIC_CALC 0.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。獲取能夠體現(xiàn)封閉群群體遺傳多樣性特征的指標(biāo)。

封閉群實(shí)驗(yàn)動物群體的遺傳結(jié)構(gòu)，通過群體的平均雜合度，群體的多態(tài)信息含量和哈代-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡來體現(xiàn)。如果群體的平均雜合度在0.5～0.7時，群體為合格的封閉群群體；如果群體的平均雜合度小于0.5時，認(rèn)為該群體趨于近交；如果群體的平均雜合度在大于0.7時，認(rèn)為該群體趨于野生。遺傳多樣性分析采用國際上通用的多態(tài)性信息量(polymorphism information content，PIC)。PIC是指一個標(biāo)記依靠其可檢測的等位基因數(shù)和它們的分布頻率，從而得到該標(biāo)記在一個群體中檢測的多態(tài)性大小值[9]。PIC值的大小在0 ～ 1之間，0表示無多態(tài)性，1表示具有非常高的多態(tài)性。PIC > 0.5為高度多態(tài)性；0.25 < PIC < 0.5為中度多態(tài)性；PIC < 0.25為低度多態(tài)性[10]。亦可以利用哈代-溫伯格(Hardy-Weinberg)定律判斷封閉群實(shí)驗(yàn)動物群體的遺傳質(zhì)量合格與否。群體內(nèi)一個位點(diǎn)上的基因型頻率和基因頻率保持不變，處于遺傳平衡狀態(tài)，這一平衡狀態(tài)就稱之為Hardy-Weinberg平衡。經(jīng)過軟件分析可以獲知群體在微衛(wèi)星位點(diǎn)是否處于Hardy-Weinberg平衡。平衡即判定為遺傳質(zhì)量合格，不平衡即判定為遺傳質(zhì)量不合格。

3 應(yīng)用前景

近交系動物微衛(wèi)星位點(diǎn)的選取不一定拘泥于20個微衛(wèi)星位點(diǎn)，可根據(jù)需要靈活調(diào)整。如果僅用于區(qū)分兩個品系的近交系小鼠，選取10個微衛(wèi)星位點(diǎn)即可滿足需求。初次應(yīng)用微衛(wèi)星方法獲得的近交系小鼠的遺傳數(shù)據(jù)可以作為該品系后續(xù)遺傳質(zhì)量檢測的依據(jù)。封閉群的動物進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析時，應(yīng)采用基礎(chǔ)群實(shí)驗(yàn)動物，動物的數(shù)量不應(yīng)小于25只。動物數(shù)量少和非基礎(chǔ)群的動物獲得的數(shù)據(jù)將對分析結(jié)果帶來偏差。

生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展離不開實(shí)驗(yàn)動物，實(shí)驗(yàn)動物的發(fā)展離不開質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)動物的遺傳質(zhì)量是所有質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CALAS 21-2017小鼠、大鼠微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測方法的建立彌補(bǔ)了現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中生化標(biāo)記檢測法的局限性，微衛(wèi)星方法的位點(diǎn)數(shù)量多且多態(tài)性豐富，位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了全基因組覆蓋[11]。微衛(wèi)星方法最突出的優(yōu)點(diǎn)是，僅需要提取少量血液樣本的DNA即可實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物的遺傳質(zhì)量檢測，無需安樂死實(shí)驗(yàn)動物，符合動物福利和3R原則[11]。標(biāo)準(zhǔn)的制定表明我國的實(shí)驗(yàn)動物遺傳質(zhì)量控制手段邁上了一個新臺階，并且逐步與國際水平接軌，有利于我國實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量整體水平的提升。