B族鏈球菌核酸檢測試劑的性能評價

張 睿 徐英春 吳 潔 竇亞玲 伊 潔 葉阿里 孔令君 楊啟文*

B族鏈球菌(group B streptococci,GBS),學名無乳鏈球菌(streptococcus agalactiae)是一種條件致病革蘭陽性菌,正常健康人感染GBS并不致病,但近代臨床觀察發(fā)現(xiàn)其在引起孕婦感染、胎兒早產(chǎn)、發(fā)育不良、胎膜早破及晚期流產(chǎn)等[1]方面的影響越來越明顯.新生兒GBS感染的臨床表現(xiàn)有肺炎、膿毒血癥、腦膜炎及菌血癥等[2-3].近年來,熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術因其具有很好的特異性和敏感性而在臨床廣泛使用,應用該技術檢測GBS能夠縮短臨床診斷時間,為進一步的治療和預防提供方法和手段,極大提高檢測效率,是孕婦產(chǎn)前篩查GBS感染的理想方法.本研究旨在驗證熒光定量PCR技術對GBS檢測的準確性和適用性,以及臨床應用的可行性.

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

MALDI-TOF鑒定后的臨床GBS菌株10株(108CFU/ml),陰道-直腸分泌物拭子56例;干擾菌株包括A族鏈球菌(編號:16W06622)、肺炎鏈球菌(編號:16E06041)、草綠色鏈球菌(編號:16W06258)、糞腸球菌(編號:18BW06368)以及大腸埃希菌(編號:18FW02400)各一株(108CFU/ml),-20 ℃保存.

1.2 儀器與試劑

采用ABI 7900型熒光PCR儀(美國賽默飛公司),使用ABI 7900 SDS Software 2.4軟件進行數(shù)據(jù)分析.GBS核酸檢測試劑盒(上海之江/江蘇碩世生物科技股份有限公司);PCR-熒光探針法的A和B試劑盒.

1.3 操作步驟

嚴格按照A和B試劑盒說明書,對同一樣本進行核酸提取、PCR反應試劑配制和加樣;分別計算A和B試劑盒檢測的陰性、陽性個數(shù).

(1)A試劑的提取方法:樣本試管中加入1 ml無菌生理鹽水,充分震蕩搖勻,吸取液體轉至1.5 ml離心管中,13000 r/min離心5 min.沉淀加無菌生理鹽水1 ml混勻,13000 r/min離心5 min,重復洗滌一次.沉淀直接加入100 μl核酸提取液充分混勻,同時加入內標1 L,99 ℃干浴或水浴10 min,13000 r/min離心10 min,取上清4 μl作為PCR反應模板.

(2)B試劑的提取方法:取1 ml無菌生理鹽水懸浮樣本于1.5 ml離心管中,充分震蕩后13000 r/min離心5 min.棄去上清,在洗滌后的標本中加入1管固態(tài)提取物(0.06 g玻璃珠),取50 μl DNA提取液加于1.5 ml離心管中,同時加入2 μl內部對照,高速渦旋震蕩2 min,99 ℃干浴2 min,立即冰浴3 min,然后13000 r/min離心1 min,取上清5 μl可直接用于下游PCR加樣擴增.

1.4 實驗方法及判定標準

1.4.1 準確性實驗

(1)鑒定后的不同GBS菌株用生理鹽水稀釋成濃度為105CFU/ml的10例,104CFU/ml的10例,103CFU/ml的1例,102CFU/ml的1例,10 CFU/ml的1例;無菌生理鹽水制成的陰性樣本5例;陰道-直腸分泌物拭子56例,分別用兩家試劑盒進行檢測.

(2)判定標準:總符合率、陽性符合率及陰性符合率應≥95%.

1.4.2 重復性實驗

(1)將已知三份陽性標本(105CFU/ml、104CFU/ml及103CFU/ml各1例)和一份陰性樣本,重復測定5次,測定2 d,計算每個標本的重復性.通過循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)計算變異系數(shù)CV%.

(2)判定標準:Ct值的變異系數(shù)≤5%.

1.4.3 檢測下限測定

(1)鑒定后的臨床GBS菌株:將上述臨床GBS菌株一株稀釋為104CFU/ml、103CFU/ml、102CFU/ml及10 CFU/ml,每個稀釋測試5次,計算標本檢出率,選取其前稀釋的值,確定該試劑的檢測下限.

(2)判定標準:若A和B試劑盒103CFU/ml稀釋品檢出率均為100%,比較102CFU/ml和10 CFU/ml檢出率,以檢出率更高者為優(yōu).

1.4.4 攜帶污染測定

(1)選取GBS陽性樣本(105CFU/ml3例,104CFU/ml2例)5例,每個陽性樣本后緊跟著無菌生理鹽水制成的陰性標本,同時提取、擴增,重復進行4次.

(2)判定標準:無菌生理鹽水制成的陰性標本檢測為陰性,即無攜帶污染.

表1 A和B試劑與測序結果總符合率、陽性符合率和陰性符合率比較(%)

1.4.5 干擾和特異性試驗

(1)檢測標本:對GBS(105CFU/ml)中分別加入等體積5例生殖道可分離的A族鏈球菌、肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、糞腸球菌及大腸埃希菌(105CFU/ml)的檢測,以保證試劑驗證GBS的準確無誤.

(2)判定標準:加入GBS(105CFU/ml)的5個樣本檢測為陽性,而未加入GBS的5個樣本檢測GBS為陰性.

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Excel2007及SPSS17.0統(tǒng)計軟件,進行總符合率、陽性符合率和陰性符合率比較.

2 結果

2.1 準確性驗證

(1)臨床菌株準確性驗證結果:A和B試劑盒檢測GBS菌株(105CFU/ml菌株和104CFU/ml各10例),陰性樣本5例與金標準(菌株鑒定)總符合率、陽性符合率和陰性符合率均為100%.

(2)臨床拭子標本準確性驗證結果:樣本經(jīng)過測序所得序列經(jīng)Blast比對,A試劑總符合率為92.86%,陽性符合率為76.47%,陰性符合率為100%>95%;B試劑總符合率、陽性符合率和陰性符合率均為100%,B試劑符合準確性驗證要求,見表1.

2.2 重復性和可報告范圍性能驗證

A和B試劑檢測GBS樣本(105CFU/ml、104CFU/ml及103CFU/ml)Ct值的CV均≤5%,3種含量標本的變異系數(shù)為B試劑較A試劑高.驗證結果見表2.

表2 A和B試劑Ct 值變異系數(shù)CV比較(%)

2.3 攜帶污染和可報告范圍驗證

每個陽性樣本攜帶1個生理鹽水制成的陰性樣本重復檢測4次,陰性對照實驗結果均為陰性,表明生理鹽水陰性對照為陰性,無攜帶污染,A和B試劑盒都符合要求.

可報告范圍驗證結論:含量為105CFU/ml和104CFU/ml樣本判斷為陽性;生理鹽水制成的陰性樣本判斷為陰性,A和B試劑盒都符合要求.

2.4 最低檢測下限驗證

A和B試劑盒在樣本含量為104CFU/ml和103CFU/ml檢出率均為100%;在樣本含量為102CFU/ml檢出率均為20%,10 CFU/ml檢出率為0,因此A和B試劑盒最低檢測下限均為103CFU/ml.驗證結果見表3.

表3 A和B試劑檢出率比較(%)

2.5 特異性和抗干擾能力驗證

加入GBS含量為105CFU/ml的A族鏈球菌、肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、糞腸球菌及大腸埃希菌5個樣本檢測GBS為陽性,而未加入GBS的5個樣本檢測GBS為陰性.A和B試劑盒都符合特異性和抗干擾實驗要求.

3 討論

GBS是西方國家新生兒圍生期感染的首要致病菌,也是引起早產(chǎn)和死胎的三大致病菌之一,美國疾病預防和控制中心于1996年、2002年和2010年制定修正了圍生期GBS感染篩查及防治指南.我國對于GBS產(chǎn)前篩查未全面普及,孕產(chǎn)婦未常規(guī)行GBS篩查,北京地區(qū)孕產(chǎn)婦GBS陽性篩查率為7.1%,深圳為18.4%,臺灣地區(qū)為20.0%[4-5].由于GBS近年來感染呈上升趨勢,在新生兒感染方面引起了嚴重后果,所以能夠快速準確的檢測GBS成為臨床確診的關鍵前提[6-8].GBS的常規(guī)檢測為細菌培養(yǎng)法,檢測時間較長,而熒光定量PCR法具備其敏感性強,準確性高[9-10]等特點在臨床實驗室檢測中作用日益突出.

在對試劑進行多角度評估過程中,準確性的驗證尤為重要,這是關系到實驗結果是否可靠的前提;一個試劑是否能達到說明書的要求,正確的檢測出靶基因并將其通過熒光信號的形式反映出來是關鍵所在.本研究實驗從總符合率,陽性符合率(分析敏感性),陰性符合率(分析特異性)3方面對試劑進行準確性的評估.A試劑因總符合率(92.86%)和陽性符合率(76.47%)均<95%,不符合驗證要求.重復性驗證反映的是試劑穩(wěn)定的指標,因為在同一時間,同一操作人員用同一批次和不同批次試劑重復加樣,最終用Ct值的CV大小來量化.雖然A和B試劑在重復性驗證過程中,CV值均≤5%,符合驗證要求,但在含量為105CFU/ml、104CFU/ml及103CFU/ml的3種含量的測定過程中,B試劑的CV值比A試劑高,這也反應出A試劑實際上在實驗操作過程中較B試劑穩(wěn)定.在攜帶污染的檢測過程中,只要操作人員遵守分子生物學實驗室的操作規(guī)定和試劑說明書要求,一般都會避免此類現(xiàn)象的發(fā)生.最低檢測下線反映的是試劑能夠檢測到的菌液最小濃度的能力,將菌液從108CFU/ml稀釋到104CFU/ml、103CFU/ml、102CFU/ml和10 CFU/ml的4種含量梯度進行重復檢測,以檢出率作為判定標準,A和B試劑在最低檢測下線的驗證中均相同(為103CFU/ml).特異性和抗干擾能力反映的是試劑是否能夠在樣本中混雜有其他物質(干擾細菌)時還能夠準確的捕捉靶基因的能力,因此本研究實驗選取了陰道-直腸內常見的幾種細菌,最終A和B試劑也都符合驗證要求.

A和B試劑在重復性、攜帶污染、最低檢測下線、特異性和抗干擾能力驗證方面均符合要求,但由于A試劑總符合率和陽性符合率均<95%,不符合驗證要求,最終,B試劑在性能驗證過程中脫穎而出.

本研究實驗從多方面對試劑進行評估,確保試劑在應用于臨床前的安全性和有效性.