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    木薯海藻糖-6-磷酸酯酶MeTPP6基因克隆及其表達(dá)分析

    2019-09-25 04:23:19丁澤紅吳春來(lái)顏彥
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年6期
    關(guān)鍵詞:木薯海藻擬南芥

    丁澤紅 吳春來(lái) 顏彥

    摘要:海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)負(fù)責(zé)海藻糖生物合成催化反應(yīng)的最后一步,是植物海藻糖生物合成途徑的關(guān)鍵酶。采用RT-PCR的方法從木薯葉片中克隆了1個(gè)TPP基因,命名為MeTPP6,該基因含有1個(gè)1 122 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼373個(gè)氨基酸,具有TPP家族保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,MeTPP6與杞柳和楊樹(shù)中同源基因的親緣關(guān)系較近,序列相似性高達(dá)89.7%和89.0%。啟動(dòng)子分析表明,MeTPP6含有干旱、低溫、熱脅迫、激素(如ABA)和光響應(yīng)等相關(guān)元件。熒光定量PCR分析表明,MeTPP6在葉片和葉柄中表達(dá)量最低;在須根和儲(chǔ)藏根中表達(dá)量最高,分別為葉片表達(dá)量的4.2倍和4.5倍。而且,MeTPP6基因的表達(dá)能被干旱、低溫和ABA處理顯著誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明,MeTPP6通過(guò)依賴于ABA的信號(hào)通路在轉(zhuǎn)錄水平參與木薯干旱和低溫脅迫,可作為重要候選基因進(jìn)一步研究其在木薯非生物逆境中的功能。

    木薯(Manihot esculenta Crantz)是大戟科熱帶地區(qū)重要的薯類(lèi)作物,具有高產(chǎn)、高淀粉和耐貧瘠等特性,在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和工業(yè)中占有非常重要的地位。木薯是一種耐旱作物,一方面木薯可以通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)閉以及新展開(kāi)葉片的表面積大小來(lái)減少蒸騰作用造成的水分損失;另一方面,木薯具有發(fā)達(dá)的根系,可以從深層(>2 m)土壤中吸收水分[1]。然而,在較長(zhǎng)時(shí)間或較為嚴(yán)重的干旱條件下,其塊根產(chǎn)量仍會(huì)顯著下降[2]。作為典型的熱帶作物,木薯主要種植在30°S至30°N之間的熱帶和亞熱帶地區(qū)。與其抗旱性相比,木薯對(duì)低溫非常敏感,在<14 ℃時(shí)木薯生長(zhǎng)比較緩慢,<10 ℃時(shí)木薯將停止生長(zhǎng)。更嚴(yán)重的是,極端的低溫氣候可以造成木薯大幅減產(chǎn)甚至絕收[3]。因此,提高木薯對(duì)干旱和低溫等脅迫的抗性,使其在不良生長(zhǎng)環(huán)境下減少產(chǎn)量損失或是維持原有產(chǎn)量具有重要意義。

    海藻糖是天然雙糖中最穩(wěn)定的糖質(zhì),在真菌、細(xì)菌、藻類(lèi)、和動(dòng)植物中廣泛存在[4]。研究表明,在干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫條件下,植物體內(nèi)海藻糖含量會(huì)大量積累[5],植物生物抗性顯著增強(qiáng)。因此,提高海藻糖含量的累積對(duì)植物抵御干旱、低溫等逆境脅迫非常重要。植物中海藻糖主要經(jīng)TPS/TPP途徑合成,即尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖分別在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,簡(jiǎn)稱(chēng)TPS)、海藻糖-6-磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,簡(jiǎn)稱(chēng)TPP)的催化作用下生成海藻糖[6]。不難看出,TPP負(fù)責(zé)海藻糖生物合成催化反應(yīng)的最后一步,是植物海藻糖生物合成途徑的1個(gè)關(guān)鍵酶。

    植物中TPP由多基因編碼,例如水稻中有13個(gè)TPP基因(OsTPP1-OsTPP13)[7],擬南芥中有10個(gè)TPP基因(AtTPPA- AtTPPJ)[8-9],它們都含有TPP基因家族保守結(jié)構(gòu)域。早在2005年,Pramanik 等從水稻中克隆了OsTPP1基因,瞬時(shí)表達(dá)表明OsTPP1受到低溫、干旱、鹽和外源脫落酸(ABA)誘導(dǎo),而且低溫處理后同時(shí)提高了TPP活性和海藻糖含量[10]。將OsTPP1基因在水稻中超表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽和低溫的耐受性增強(qiáng)[7]。進(jìn)一步功能分析表明,OsTPP1可以激活脅迫相關(guān)基因的表達(dá),從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性[7]。重要的是,Nuccio等將OsTPP1基因在玉米中超表達(dá)后,多年份多地點(diǎn)田間試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)基因植株在正常和干旱條件下均可以增加玉米產(chǎn)量[11]。由此可見(jiàn),OsTPP1是1個(gè)重要的作物抗逆遺傳改良的候選基因。另1個(gè)水稻TPP基因OsTPP7,最近被證明通過(guò)糖代謝調(diào)控增強(qiáng)水稻厭氧萌發(fā)的耐受性[12]。在擬南芥中,Vogel等通過(guò)酵母互補(bǔ)試驗(yàn)鑒定并克隆了2個(gè)擬南芥TPP基因AtTPPA和AtTPPB[13]。研究發(fā)現(xiàn),AtTPPA和AtTPPB表達(dá)后可以互補(bǔ)tps2突變體的功能,并能夠在體內(nèi)(in vivo)和體外(in vitro)試驗(yàn)中檢測(cè)到TPP活性[13]。此外,擬南芥TPP基因家族成員的表達(dá)也受到低溫、干旱、鹽和ABA處理的調(diào)控[9]。

    然而,目前這些研究主要集中在模式植物擬南芥和水稻中,在熱帶作物(如木薯)中尚沒(méi)有關(guān)于TPP基因克隆及其響應(yīng)非生物脅迫的研究報(bào)道。本研究采用RT-PCR的方法從木薯葉片中克隆了1個(gè)TPP基因(命名為MeTPP6),分析其保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和啟動(dòng)子元件,并通過(guò)qRT-PCR分析了其在不同組織中以及在干旱、低溫和外源ABA處理下的表達(dá)水平,旨在為進(jìn)一步研究MeTPP6在木薯非生物逆境響應(yīng)中的功能奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    本研究所用材料為木薯主推栽培品種Ku50,具有高淀粉、抗逆性好等特點(diǎn),由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。植物RNA提取試劑盒(貨號(hào):DP437)購(gòu)自天根生化科技有限公司,cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):K1622)購(gòu)自Fermentas 公司。本研究中PCR引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 木薯種植與處理

    按照丁澤紅等方法[14]進(jìn)行木薯種植。將Ku50種莖切成15 cm左右的莖段,選擇粗細(xì)均勻且含有3~4個(gè)芽眼的莖段種植于塑料盆(上直徑18.5 cm,下直徑14.8 cm,高18.8 cm),每盆種植1個(gè)莖段。將蛭石和營(yíng)養(yǎng)土按照1 ∶ 1的體積比混合后作為木薯基質(zhì)。種植約10 d后對(duì)木薯進(jìn)行間苗,每盆只保留1棵苗。試驗(yàn)時(shí)間為2013年5月,試驗(yàn)地點(diǎn)為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。木薯種植60 d后,分別進(jìn)行低溫、干旱和ABA處理。(1)低溫處理:將生長(zhǎng)狀況一致的植株放置于光照培養(yǎng)箱,進(jìn)行4 ℃低溫脅迫處理。在處理0、6、24 h 后,分別收集第1張完全展開(kāi)葉、未展開(kāi)葉和根的樣品,-80 ℃保存?zhèn)溆谩#?)干旱處理:采用PEG-6000進(jìn)行干旱模擬處理。處理植株澆灌20%的PEG-6000溶液,對(duì)照植株不施PEG(采用澆灌自來(lái)水代替)。在處理0、3和24 h 后,分別收集第1張完全展開(kāi)葉、未展開(kāi)葉、老葉和根的樣品,-80 ℃保存?zhèn)溆?。?)ABA處理:采用 100 μmol/L ABA溶液進(jìn)行澆灌處理,在處理0、3、5、7 d 后收集第1張完全展開(kāi)葉的樣品,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    為了研究不同組織中MeTPP6基因的表達(dá)情況,還收集了正常種植條件下木薯Ku50的根(包括須根和儲(chǔ)藏根)、莖、葉和葉柄的樣本,用于qRT-PCR分析。

    1.3 引物合成及qRT-PCR

    1.4 生物信息學(xué)分析

    參照丁澤紅等方法[14]進(jìn)行生物信息學(xué)分析,具體描述如下:用BLASTP搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù),獲取其他物種中與MeTPP6同源的蛋白質(zhì)序列;用ExPASy ProtParam計(jì)算蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量;用Plant-mPLoc預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位;用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域;用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì);用MEGA 5.2構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);用PlantCARE分析啟動(dòng)子元件;用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MeTPP6基因克隆

    在前期木薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了1個(gè)在干旱脅迫下差異表達(dá)基因(cassava4.1_009931m.g),之后根據(jù)Phytozome木薯數(shù)據(jù)庫(kù)提供的參考序列,設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。經(jīng)測(cè)序后獲得1條全長(zhǎng)為1 122 bp的序列,編碼373個(gè)氨基酸(圖2),根據(jù)其與水稻TPP基因的同源性將其命名為MeTPP6。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),MeTPP6與參考序列之間僅存在1個(gè)堿基差異,可引起氨基酸編碼的改變。ProtParam預(yù)測(cè)MeTPP6蛋白的分子式為C1 876H2 988N510O544S14,總原子數(shù)目為5 932,理論等電點(diǎn)(pI值)為9.31,分子量為 41 840.3 ku,不穩(wěn)定系數(shù)為27.48,屬于穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)定位于液泡或葉綠體。NCBI-CDD保守結(jié)構(gòu)域分析表明,MeTPP6編碼的蛋白含有TPP基因家族保守結(jié)構(gòu)域(Trehalose_PPase)(圖2),屬于木薯TPP基因家族成員。

    2.2 MeTPP6系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

    通過(guò)BlastP工具在線搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)獲取與MeTPP6同源性較高的其他物種中的蛋白質(zhì)序列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。聚類(lèi)后發(fā)現(xiàn),這些基因可以分為3組(圖3):第Ⅰ組包括許多C4植物,如小米、狗尾草、黍羊Panicum hallii、柳枝稷、玉米、高粱和二穗短柄草;水稻TPP基因也被聚類(lèi)在第Ⅰ組,它與二穗短柄草的同源基因親緣關(guān)系較近,序列相似度高達(dá)87.8%。木薯MeTPP6基因被聚類(lèi)在第Ⅱ組,它與杞柳(SapurV1A.0684s0130.1)和楊樹(shù)(Potri.005G077200.1)中同源基因的親緣關(guān)系較近,序列相似性分別為89.7%和89.0%。擬南芥TPP基因被聚類(lèi)在第Ⅲ組,同時(shí)還包含了其他十字花科的物種,如白菜型油菜、薺菜花、琴葉擬南芥和鼠耳芥等。

    2.3 MeTPP6基因啟動(dòng)子分析

    啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)起重要調(diào)控作用,它決定著基因的轉(zhuǎn)錄起始和表達(dá)程度。本研究選取MeTPP6起始密碼子上游 1 500 bp 的序列進(jìn)行啟動(dòng)子分析,發(fā)現(xiàn)了許多與逆境響應(yīng)相關(guān)的元件,如干旱誘導(dǎo)元件MBS、低溫響應(yīng)元件LTR、低溫和干旱響應(yīng)元件C-repeat/DRE、熱脅迫響應(yīng)元件HSE以及防御與脅迫相關(guān)元件TC-rich repeats(表1)。除此之外,還發(fā)現(xiàn)了許多與激素響應(yīng)相關(guān)的元件,如水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、茉莉酸響應(yīng)元件TGACG-motif和CGTCA-motif、赤霉素響應(yīng)元件P-box和GARE-motif、脫落酸(ABA)響應(yīng)元件ABRE,以及許多與光響應(yīng)相關(guān)的元件,包括MRE、ACE、G-Box、Sp1和box II等。這些研究結(jié)果表明,MeTPP6可能參與木薯干旱、低溫、高溫、激素和光響應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控。

    2.4 MeTPP6在木薯不同組織中的表達(dá)分析

    TPS基因的表達(dá)量在植物不同組織器官中存在較大差異。本研究考察了MeTPP6基因在木薯Ku50不同組織中的表達(dá)情況,結(jié)果表明,MeTPP6在葉片和葉柄中表達(dá)量最低;莖中表達(dá)量較高,約為葉片中表達(dá)量的2.1倍;須根和儲(chǔ)藏根中表達(dá)量最高,分別為葉片中表達(dá)量的4.2倍和4.5倍(圖4)。這些結(jié)果表明,MeTPP6基因主要在木薯的須根和儲(chǔ)藏根中起作用。

    2.5 MeTPP6在不同脅迫條件下的表達(dá)分析

    本研究在MeTPP6基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了干旱、低溫和ABA響應(yīng)相關(guān)的元件。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MeTPP6的功能,本研究分別在干旱、低溫和ABA處理?xiàng)l件下考察了MeTPP6基因的表達(dá)模式(圖5)。

    在PEG-6000脅迫條件(模擬干旱)下,在處理3、24 h后MeTPP6在老葉中的表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢(shì),但表達(dá)量無(wú)顯著差異;在第1張完全展開(kāi)葉中,MeTPP6的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì),在處理3、24 h后分別下降了19%和上升了1.3倍;在未展開(kāi)葉,MeTPP6的表達(dá)量呈現(xiàn)先不變后上升的變化趨勢(shì),在處理24 h后上升了1.8倍;在根中,MeTPP6的表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)上升的變化趨勢(shì),在處理3、24 h后分別上升了1.3倍和1.5倍(圖5-A)。

    在低溫脅迫下,在未展開(kāi)葉和第1張完全展開(kāi)葉,MeTPP6的表達(dá)量在處理6、24 h后均呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢(shì),其表達(dá)量分別下降了56%和64%、49%和65%;不同的是,根中MeTPP6的表達(dá)量在處理6、24 h后呈現(xiàn)持續(xù)上升的變化趨勢(shì),其表達(dá)量分別上升了3.8倍和8.1倍(圖5-B)。

    在ABA處理?xiàng)l件下,MeTPP6在葉片中的表達(dá)量顯著上升了,在處理3、5、7 d后分別上升了1.4倍、1.7倍、1.9倍(圖5-C)。

    這些結(jié)果充分表明,MeTPP6基因在轉(zhuǎn)錄水平參與干旱、低溫和ABA處理響應(yīng),可作為候選基因進(jìn)一步研究其在木薯抗逆中的功能。

    3 討論與結(jié)論

    海藻糖是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),提高植物體內(nèi)海藻糖含量可以增強(qiáng)植物對(duì)干旱、低溫等非生物脅迫的抗性[16]。TPS和TPP是海藻糖生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。與TPS相比,有關(guān)植物TPP基因克隆的研究還很少,且大多數(shù)報(bào)道都集中在模式植物擬南芥和水稻中。擬南芥中共有10個(gè)TPP基因,水稻中有13個(gè)TPP基因,它們都含有TPP基因家族保守結(jié)構(gòu)域[7-8]。研究表明,提高TPP基因的表達(dá)量可以增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的抗性。在擬南芥中超表達(dá)AtPPD基因后,轉(zhuǎn)基因植株抗鹽能力增強(qiáng)[17];在水稻中超表達(dá)OsTPP1基因后,轉(zhuǎn)基因植株中OsTPP1表達(dá)量上升,其對(duì)低溫、鹽和干旱脅迫的抗性增強(qiáng)[7,10]。進(jìn)一步試驗(yàn)表明,ABA代謝參與OsTPP1基因的表達(dá)調(diào)控[10]。而且,在玉米中超表達(dá)OsTPP1基因后發(fā)現(xiàn),在正常和干旱條件下均可以增加玉米產(chǎn)量[11]。可見(jiàn),TPP是1個(gè)非常重要的抗逆候選基因,可用于作物抗逆遺傳改良育種。本研究通過(guò)RT-PCR的方法從木薯葉片中克隆了1個(gè)TPP基因MeTPP6,序列分析表明MeTPP6編碼373個(gè)氨基酸,含有TPP基因家族保守結(jié)構(gòu)域,屬于木薯TPP基因家族成員。進(jìn)化樹(shù)分析表明,它與杞柳和楊樹(shù)中TPP基因的親緣關(guān)系較近,序列相似性分別為89.7%和89.0%。

    TPP基因在不同組織中的表達(dá)具有較大差異。例如擬南芥AtTPPA、AtTPPF和AtTPPG主要在花粉表達(dá),AtTPPB主要在胚根、側(cè)根以及根的伸長(zhǎng)區(qū)表達(dá),而AtTPPE主要在子葉和木質(zhì)部表達(dá)[9],暗示不同TPP成員可能傾向于在不同組織中發(fā)揮功能。本研究發(fā)現(xiàn)MeTPP6在葉片和葉柄中表達(dá)量最低,在須根和儲(chǔ)藏根中表達(dá)量最高,支持MeTPP6基因主要在木薯的須根和儲(chǔ)藏根中起作用。

    TPP基因表達(dá)受到低溫、干旱、鹽、機(jī)械損傷和滲透脅迫等調(diào)控,且不同TPP成員對(duì)各種處理的響應(yīng)不一樣。例如,在擬南芥幼苗中,AtTPPE、AtTPPF、AtTPPG和AtTPPJ的表達(dá)均受到低溫、鹽和滲透脅迫的誘導(dǎo),AtTPPA和AtTPPH的表達(dá)僅受到低溫脅迫誘導(dǎo)但被鹽和滲透脅迫抑制[9]。在根中,AtTPPD、AtTPPF和AtTPPI的表達(dá)均受到低溫、鹽和滲透脅迫的誘導(dǎo);AtTPPA、AtTPPE和AtTPPG的表達(dá)受到低溫和鹽脅迫的誘導(dǎo),但對(duì)滲透脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式;而AtTPPB和AtTPPH的表達(dá)則受到低溫、鹽和滲透脅迫的抑制[9]。此外,不同TPP成員對(duì)激素的響應(yīng)也不一樣。AtTPPA和AtTPPB的表達(dá)受到ABA處理抑制,AtTPPI和AtTPPD的表達(dá)受到ABA處理誘導(dǎo),而AtTPPE、AtTPPG和AtTPPF的表達(dá)則同時(shí)受到ABA和JA處理誘導(dǎo)[9]。水稻中OsTPP1基因的表達(dá)也受到低溫、干旱、鹽和外源ABA激素的誘導(dǎo)[7,10]。本研究在MeTPP6啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一系列與干旱、低溫、防御和脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件,表達(dá)分析也進(jìn)一步證實(shí),MeTPP6基因的表達(dá)量受到干旱和低溫的調(diào)控。植物響應(yīng)外界非生物脅迫的信號(hào)路徑主要分為依賴于ABA信號(hào)通路和不依賴于ABA信號(hào)通路2種[18]。本研究在MeTPP6啟動(dòng)子區(qū)域多個(gè)位置發(fā)現(xiàn)了與ABA響應(yīng)相關(guān)的元件ABRE,且表達(dá)分析結(jié)果也表明MeTPP6基因表達(dá)是響應(yīng)ABA信號(hào)的。因此,本研究推測(cè)MeTPP6可能是通過(guò)依賴于ABA的信號(hào)通路參與木薯干旱和低溫等非生物脅迫調(diào)控。這些結(jié)果將為進(jìn)一步研究MeTPP6基因在木薯抗逆中的功能提供理論參考。

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