MiR-217調(diào)節(jié)ERK1/2表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

唐玲玉，李全朋，葛賢秀，聶俊杰，王 飛，繆 林

0 引 言

結(jié)直腸癌是世界上第三大常見的惡性腫瘤，同時是導(dǎo)致死亡的第四大癌癥，約導(dǎo)致了2012年140萬的新發(fā)病例和70萬左右的死亡人數(shù)［1-2］。我國的結(jié)直腸癌發(fā)生率和死亡率也一直居高不下［3］，故結(jié)直腸癌的診斷和治療方面的研究極為重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的、內(nèi)源性的、長約21～23nt的單鏈RNA，miRNA的發(fā)現(xiàn)人類了解癌癥開拓了新的視角［4］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)微小miRNA除了有作為癌癥診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力之外，目前最熱門的研究內(nèi)容之一是研發(fā)靶向差異表達(dá)的miRNA的治療策略［5-6］。

在之前的研究中，部分miRNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌的進(jìn)展相關(guān)［7］，如miR-31可以通過負(fù)性調(diào)節(jié)RASA1（RAS P21 Protein Activator 1），從而激活KRAS系統(tǒng)，以發(fā)揮其在結(jié)直腸癌中的促癌作用后添加的參考文獻(xiàn)［8］。MiR-217在結(jié)直腸癌中的研究甚少，本研究旨在闡明miR-217在結(jié)直腸癌患者癌組織中的表達(dá)水平、生物學(xué)作用和臨床意義。此外，我們還進(jìn)一步探索了miR-217在結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞增殖中通過ERK1/2發(fā)揮部分作用。

1材料與方法

1.1 來源標(biāo)本收集2015年1月至2019年1月于在南醫(yī)大二附院50份結(jié)直腸癌組織標(biāo)本（結(jié)直腸癌和癌旁組織），并迅速保存于液氮。根據(jù)瘤體直徑分為腫瘤＞5 cm（n=22）和≤5 cm（n=28）。病理分期、分級和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移等信息由本院經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床病理醫(yī)師評估，結(jié)直腸癌Ⅰ-Ⅱ期標(biāo)本有18份，IIIIV期32份。根據(jù)miR-217的表達(dá)中位數(shù)，將標(biāo)本分為miR-217高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、HT29、SW480以及正常腸上皮細(xì)胞HcoEpiC購自中國科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)庫（中國上海）。結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29和SW480在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，正常的結(jié)直腸上皮細(xì)胞Hco-Epic在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿于37℃、5%CO2和相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度至70%～90%時用胰酶進(jìn)行消化、傳代。

1.3 RNA分離和qPCR分析根據(jù)說明書用Trizol試劑（Life，美國）從組織或細(xì)胞中提取總RNA 后 ，用 NanoDrop2000c（Thermo Fisher Scientific，美國）測定RNA的總量和提取質(zhì)量。分別用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量試劑盒完成RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的定量，并將所得CT值根據(jù)GAPDH 用 2^（-ΔΔCT）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。引物序列為：GAPDH，正義鏈CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，反義鏈 GCGCCCAATACGACCAAATC；miR-217，正 義 鏈 CATGCTCGAGCTTATCAAGGATAAAATACCAT，反 義 鏈 GTTACGGCCGCTTGAGATCTACTCTAATTTCTTTTTTAAC；CyclinD1，正義鏈CAATGACCCCGCACGATTTC， 反義鏈 CATGGAGGGCGGATTGGAA；Bax，正義鏈 CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG，反 義 鏈 CCAGCCCATGATGGTTCTGAT；Bcl-2，正義鏈，GGTGGGGTCATGTGTGTGG，反義鏈CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC。相對表達(dá)量以2（-ΔΔCT）法表示。

1.4 細(xì)胞分組和處理細(xì)胞匯合度約50%～60%時對細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimic（control mimic、miR-217 mimic）或inhibitor（control inhibitor、miR-217 inhibitor）和進(jìn)行ERK1/2抑制劑（U1026）處理。具體分組為：過表達(dá)對照組（轉(zhuǎn)染control mimic）和miR-217過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-217 mimic）、低表達(dá)對照組（轉(zhuǎn)染control inhibitor）和miR-217低表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-217 inhibitor）以及miR-217&ERK1/2低表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-217 inhibitor+U0126）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟具體參照Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen，美國）說明書。ERK1/2抑制劑具體處理：將U0126用DMSO溶解，處理細(xì)胞的使用濃度為50μmol/L。用U0126處理細(xì)胞時每1～2天進(jìn)行一次換液。

1.5 細(xì)胞增殖試驗(yàn)用CCK-8測定試劑盒（biosharp，中國）進(jìn)行細(xì)胞增殖測定，具體操作步驟為：各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理24 h后，將SW480和HCT116細(xì)胞（3000個細(xì)胞/孔）轉(zhuǎn)移至96孔板中生長，并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24小時使用CCK-8測定法（A450nm）檢測細(xì)胞活力，具體來說，向每個孔中加入20μL CCK-8溶液，并在孵育2 h后通過酶標(biāo)儀對每個孔進(jìn)行測量。每個樣品一式三份進(jìn)行分析。

1.6 克隆形成試驗(yàn)細(xì)胞處理24 h后，在6孔板每個孔中接種100個細(xì)胞，將細(xì)胞放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)7～12 d后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，隨后用2 mg/mL甘氨酸中和，最后用0.1%結(jié)晶紫染色細(xì)胞，拍照并觀察。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行至少3次。

1.7 Edu實(shí)驗(yàn)根據(jù)說明書使用EdU標(biāo)記/檢測試劑盒（Ribobio，廣州）評估細(xì)胞的增殖。簡言之，將SW480和HCT116細(xì)胞在96孔板的每孔種植5×103個細(xì)胞。用相應(yīng)處理方法處理96孔板中的細(xì)胞48 h后，將含50μmol/L EdU的培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)物中并在37℃、5%CO2孵箱中孵育2 h。此后，將細(xì)胞用4%多聚甲醛（pH7.4）固定30 min，并在室溫下用0.5%Triton X-100處理20 min。用PBS洗滌后，將樣品在室溫下用抗EdU工作溶液染色30 min。隨后，將細(xì)胞與100 μL Hoechst（5 μg/mL）在室溫下孵育30 min后在熒光顯微鏡下觀察和拍照。每個樣品一式三份進(jìn)行分析。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析收集細(xì)胞后使用RIPA裂解細(xì)胞。將勻漿置于冰上30 min，并在4℃下以12 000×g離心15 min。然后，使用BCA試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）測定裂解物的蛋白質(zhì)濃度，加入Loading buffer后100℃處理10 min。將等量的總蛋白質(zhì)加載到10%梯度聚丙烯酰胺凝膠上，電泳后使用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后在室溫下用10%脫脂牛奶封閉2 h。將PVDF膜與特異性一抗在4℃溫育過夜，并在室溫下用相應(yīng)的二抗孵育1 h。使用ECL印跡檢測試劑（Thermo Fisher Scientific，美國）顯影拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間均值比較采用t檢驗(yàn)。組間的生存分析通過Log-rank檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MiR-217在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株中低表達(dá)癌組織中miR-217表達(dá)量低于癌旁組織（P＜0.01）；直徑＞5 cm的瘤體中miR-217的表達(dá)量顯著低于直徑≤5 cm的瘤體（P＜0.01）；Ⅰ-Ⅱ期結(jié)直腸癌組織中miR-217表達(dá)顯著高于Ⅲ-Ⅳ期組織（P＜0.05），見表1。MiR-217高表達(dá)組患者生存期低于miR-217低表達(dá)組（P＜0.01），見圖1。此外，miR-217在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞HcoEpic中的表達(dá)（1.007±0.005）顯著高于結(jié)直腸癌細(xì)胞株 SW480（0.306±0.068）、HT29（0.471±0.034）、HCT116（0.576±0.066）中的表達(dá)（P＜0.01）。

表1 miR-217表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系（±s）Table 1 Correlation of miR-217 expression and clinicopathological characteristics（ ± s）

表1 miR-217表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系（±s）Table 1 Correlation of miR-217 expression and clinicopathological characteristics（ ± s）

與癌旁組織比較，*P＜0.01；與直徑≤5 cm，#P＜0.01；與Ⅰ-Ⅱ期比較，△P＜0.05

變量組織癌旁組織癌組織直徑≤5 cm＞5 cm分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期n 50 50 28 22 18 32 miR-217相對表達(dá)量2.244±0.168-1.360±0.645*-0.587±0.288-1.718±0.272#-0.413±0.330-1.463±0.260△

圖1 MiR-217高表達(dá)組和低表達(dá)組生存曲線Figure 1 Survival curve of high and low miR-217 expression groups

2.2 MiR-217過表達(dá)抑制SW480增殖MiR-217過表達(dá)組miR-217的表達(dá)量顯著高于過表達(dá)對照組，克隆形成數(shù)量顯著少于過表達(dá)對照組（P＜0.01），見表2。MiR-217過表達(dá)組在轉(zhuǎn)染后48、72、96h細(xì)胞活力均顯著低于過表達(dá)對照組（P＜0.01），見圖2。MiR-217過表達(dá)組細(xì)胞增殖比例相較于過表達(dá)對照組也有所下降，見圖3。

表2 SW480和HCT116細(xì)胞中各組MiR-217表達(dá)量和克隆形成情況（± s）Table 2 MiR-217 expression and colony formation ofeach group（ ± s）

表2 SW480和HCT116細(xì)胞中各組MiR-217表達(dá)量和克隆形成情況（± s）Table 2 MiR-217 expression and colony formation ofeach group（ ± s）

與過表達(dá)對照組比較，*P＜0.01

細(xì)胞SW480過表達(dá)對照組miR-217過表達(dá)組HCT116低表達(dá)對照組MiR-217低表達(dá)組MiR-217表達(dá)量1.004±0.003 15.120±0.522*1.006±0.003 0.207±0.021*克隆形成數(shù)量439.70±18.91 199.30±15.62*171.00±7.00 237.30±12.14*

圖2 MiR-217表達(dá)量對結(jié)直腸癌細(xì)胞株活力的影響Figure 2 Effects of miR-217 expression on cell viability of colorectal cell lines

圖3 MiR-217表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響（×200）Figure 3 Effects of miR-217 expression on proliferation of colorectal cell lines（×200）

2.3 抑制MiR-217促進(jìn)HCT116增殖MiR-217低表達(dá)組miR-217的表達(dá)量顯著低于低表達(dá)對照組，克隆形成數(shù)量顯著多于低表達(dá)對照組（P＜0.01），見表2。MiR-217低表達(dá)組在轉(zhuǎn)染后72、96 h細(xì)胞活力均顯著高于低表達(dá)對照組（P＜0.01），見圖2。細(xì)胞增殖比例相較于低表達(dá)對照組也有所增加，見圖3。

2.4 MiR-217通過下調(diào)ERK1/2表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖MiR-217過表達(dá)組CyclinD1、Bcl-2（0.348±0.028、0.593±0.071）的mRNA水平顯著低于過 表 達(dá) 對 照 組（1.008±0.006、1.008±0.005），Bax（2.108±0.189）的mRNA水平顯著高于過表達(dá)對照組（1.012±0.009），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，miR-217在SW480中過表達(dá)后，ERK1/2的蛋白表達(dá)下降；而miR-217在HCT116中受到抑制后，ERK1/2的蛋白表達(dá)增加，見圖4。在抑制miR-217表達(dá)的HCT116細(xì)胞中同時抑制ERK1/2，細(xì)胞活力在72、96 h重新得到下調(diào)（P＜0.01），見圖5。MiR-217低表達(dá)組較miR-217&ERK1/2低表達(dá)組克隆形成數(shù)量顯著減少（P＜0.01）。Edu實(shí)驗(yàn)也顯示，在HCT116細(xì)胞中抑制ERK1/2的表達(dá)可使因miR-217下調(diào)而增強(qiáng)的增殖能力下降，見圖6。

圖4 SW480和HCT116細(xì)胞株中ERK1/2的表達(dá)Figure 4 Expression of ERK1/2 in SW480 and HCT116cell lines

圖5 MiR-217低表達(dá)組和miR-217&ERK1/2低表達(dá)組HCT116細(xì)胞活力Figure 5 CellviabilityofmiR-217inhibitorgroupandmiR-217 inhibitor+ERK inhibitor group in HCT116 cellline

圖6 MiR-217低表達(dá)組和miR-217&ERK低表達(dá)組HCT116細(xì)胞株增殖情況Figure 6 ProliferationofmiR-217inhibitorgroupandmiR-217 inhibitor+ERK inhibitor group in HCT116 cellline

3 討 論

根據(jù)時間概況和人口統(tǒng)計(jì)，預(yù)計(jì)到2030年結(jié)直腸癌的疾病負(fù)擔(dān)將增加60%，將發(fā)生超過220萬的新病例和110萬結(jié)直腸癌死亡人數(shù)［9］。如果早期發(fā)現(xiàn)疾病，局部病變的治愈性手術(shù)是治療結(jié)直腸癌的最佳方法。因此，結(jié)直腸癌的早期診斷是治療該疾病的重要步驟之一［10-11］。越來越多的證據(jù)表明，各種生物標(biāo)志物，包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)可用作各種疾?。ㄈ绺鞣N類型的癌癥、中風(fēng)、流產(chǎn)等）診斷和治療的生物標(biāo)志物［6，12-14］。例如，已有研究表明血清中的miRNA-141能夠作為結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的早診標(biāo)志物［15-17］，且研究的初步結(jié)果已經(jīng)證實(shí)miRNA-141與結(jié)直腸癌的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

MiR-217在目前的研究中顯示在多種癌癥中下調(diào)［18-20］，并且通過不同的機(jī)制來參與癌細(xì)胞凋亡、耐藥、轉(zhuǎn)移等。此外，miR-217在胃癌和乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)［21-22］。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-217是作為促癌還是抑癌miRNA起作用取決于腫瘤類型。值得注意的是，結(jié)直腸癌中miR-217的研究甚少。與之前已有的研究一致［23-24］，我們發(fā)現(xiàn)miR-217在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中下調(diào)。MiR-217的過表達(dá)在體外抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的表型，而抑制miR-217的表達(dá)則得到相反的結(jié)果，具體表現(xiàn)為miR-217可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。之前的研究中顯示大部分結(jié)直腸癌患者中，腫瘤細(xì)胞的增殖都由ERK1/2通路調(diào)控［25］。所以，ERK1/2一直是結(jié)直腸癌重要的治療靶點(diǎn)。而在我們的研究中發(fā)現(xiàn)miR-217的表達(dá)被敲低后，ERK1/2的表達(dá)顯著上調(diào)。相應(yīng)的拯救實(shí)驗(yàn)也表明，即使在miR-217被敲低的HCT116細(xì)胞中，重新下調(diào)ERK1/2的表達(dá)可使HCT116的增殖受到抑制。簡言之，miR-217抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用與其下游的ERK1/2密不可分，但miR-217具體通過何種方式調(diào)節(jié)ERK1/2的表達(dá)仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明miR-217在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中顯著低表達(dá)，且與結(jié)直腸癌患者的臨床分期、腫瘤大小、生存期相關(guān)。此外，進(jìn)一步研究表明miR-217可通過下調(diào)ERK1/2的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。MiR-217或許有望成為結(jié)直腸癌患者診斷和治療的新靶標(biāo)。