戊酸雌二醇對去卵巢大鼠下丘腦視前區(qū)腎上腺素能受體表達(dá)的影響

馬曉艷，王文娟，李銀鳳，劉改文，秦麗華

0 引 言

潮熱是圍絕經(jīng)期婦女最典型的癥狀，嚴(yán)重時明顯影響女性生活質(zhì)量。潮熱發(fā)生的確切機(jī)制仍然不清，但其發(fā)生作為一種異常的散熱過程與下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞的神經(jīng)元突然發(fā)放沖動有關(guān)。目前國際公認(rèn)潮熱的發(fā)生是中樞體溫調(diào)節(jié)熱中性帶（thermoneutral zone）變窄學(xué)說［1-3］。我們前期工作觀察到，去卵巢大鼠下丘腦視前區(qū)溫度敏感核團(tuán)的溫度敏感范圍減少［4］，與此學(xué)說結(jié)論一致。圍絕經(jīng)期婦女下丘腦視前區(qū)（preoptic anterior hypothalamus，POAH）體溫調(diào)節(jié)功能的失調(diào)涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)和雌激素對體溫調(diào)節(jié)神經(jīng)元的共同影響。1963年，F(xiàn)eldberg和Myers［5］首次發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素和5-HT在下丘腦視前區(qū)的平衡狀態(tài)決定體溫調(diào)定點水平的高低。我們的前期工作提示，中樞5-HT系統(tǒng)參與圍絕經(jīng)期潮熱的發(fā)生［6］。腎上腺素α2受體激動劑可樂定可以提升有潮熱癥狀婦女的熱閾值，以此來增寬熱中性帶來緩解潮熱癥狀，支持了腦內(nèi)高水平的去甲腎上腺素可以縮窄熱中性帶的假說［7］。雌激素是緩解圍絕經(jīng)期潮熱癥狀最有效的藥物，但潮熱發(fā)生似乎與雌激素的絕對水平無關(guān)，而與雌激素撤退后的波動水平有關(guān)系［8］。雌激素對腦內(nèi)腎上腺素能受體的調(diào)節(jié)作用可能是潮熱發(fā)生的主要機(jī)制之一［9］。研究表明，去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）可激動所有的腎上腺素能受體［10］，作用的受體不同，其發(fā)揮的功能就不同［11］。下丘腦腎上腺素能受體對體溫的調(diào)節(jié)主要是通過α受體的作用，β受體并不參與這一調(diào)節(jié)［12］。腎上腺素α1受體可能與散熱相關(guān)［13］，腎上腺素α2受體主要參與潮熱的啟動過程，但目前為止，去甲腎上腺素系統(tǒng)在圍絕經(jīng)期潮熱癥狀中的變化仍然缺少基礎(chǔ)方面的研究。本研究擬觀察與體溫調(diào)節(jié)關(guān)系密切的腎上腺素α1和腎上腺素α2受體在去卵巢大鼠以及雌激素類藥物干預(yù)后的丘腦視前區(qū)的表達(dá)變化，以期探討圍絕經(jīng)期潮熱發(fā)生的中樞神經(jīng)遞質(zhì)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物清潔級雌性SD大鼠30只，體重（230±10）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2016-0041。實驗前置大鼠于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，并用去大豆的顆粒型飼料喂養(yǎng)至實驗結(jié)束，去除植物雌激素對實驗結(jié)果的影響。室溫維持在25℃，相對濕度50%～55%，光暗周期為12 h：12 h，實驗期間大鼠允許自由飲水和攝食。

1.1.2 主要試劑抗α1-腎上腺素受體、抗α2-腎上腺素受體兔多克隆抗體購自英國Abcom公司；戊酸雌二醇由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司生產(chǎn)，批號169A 11，商品名補佳樂，1mg/粒。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組待30只實驗動物適應(yīng)周圍環(huán)境1周后，隨機(jī)數(shù)字表法分為去卵巢組（OVX組）、假手術(shù)組、OVX后戊酸雌二醇處理（OVX+E2）組，各10只。無菌條件下進(jìn)行手術(shù)。大鼠麻醉成功后，腹部正中2～3 cm長切口，假手術(shù)大鼠只打開盆腔找到卵巢，并未將其切除；OVX組和（OVX+E2）組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，（OVX+E2）組行戊酸雌二醇灌胃。所有大鼠術(shù)后第3天開始行陰道細(xì)胞涂片觀察手術(shù)效果，連續(xù)5 d出現(xiàn)外底層細(xì)胞證明大鼠體內(nèi)雌激素水平降低，卵巢摘除手術(shù)成功。

1.2.2 給藥劑量和途徑所有大鼠術(shù)后恢復(fù)2周，開始進(jìn)行實驗研究處理。實驗用藥按照前期工作的方法配制：戊酸雌二醇片劑超聲處理后溶于無菌等滲鹽水中形成均勻的渾濁液。戊酸雌二醇的配制濃度為0.2 mg/mL；于每日上午8：30-9：30按照以下劑量灌胃給藥。OVX組：等滲鹽水灌胃，10 mL/kg；假手術(shù)組：等滲鹽水灌胃，10 mL/kg；（OVX+E2）組：戊酸雌二醇灌胃，0.8 mg/kg；大鼠隔日稱重，根據(jù)體重變化調(diào)整用藥量。

1.2.3 切片制備藥物治療滿4周后，用1%戊巴比妥鈉（40 mL/kg）麻醉大鼠，開胸暴露心臟，剪開右心耳，左心室插管至升主動脈，200 mL等滲鹽水沖洗血液，然后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH7.4，4℃）300 mL灌注固定，先快后慢。灌畢，立即取腦并置于含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH7.4，4℃）后固定4～6 h，傾去固定液，用自來水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。

1.2.4 免疫組化染色制作4μm厚切片，裱片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上。60℃烤箱烤片120 min。二甲苯脫蠟：二甲苯液體Ⅰ脫蠟30 min，二甲苯液體Ⅱ脫蠟30 min。梯度乙醇水化：依次無水乙醇Ⅰ10 min，無水乙醇Ⅱ10 min，95%乙醇10 min，80%乙醇10 min；PBS（pH=7.4）沖洗3次，每次3min。抗原修復(fù)：使用微波爐修復(fù)法，取一定量的檸檬酸緩沖液（緩沖液量不少于500 mL）于微波盒中，微波加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中高檔微波繼續(xù)處理15～20 min，取出微波盒冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次。PBS（pH=7.4）沖洗3次，每次3 min。滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%雙氧水在室溫下孵育10 min。PBS（pH=7.4）沖洗3次，每次3 min。第一抗體孵育：甩去PBS液，并吸水紙吸除多余PBS液，滴加入兔抗腎上腺素α1受體（1∶500，abcom），兔抗腎上腺素α2受體（1∶500，abcam），5張切片上分別滴加PBS作為陰性對照，37℃恒溫箱孵育1 h。PBS（pH=7.4）沖洗3次，每次3 min。生物素標(biāo)記第二抗體孵育：甩去PBS液，并吸水紙吸除多余PBS液，滴加第二抗體（本抗體為即用型直接滴加蓋過組織即可），室溫下孵育30min，PBS（pH=7.4）沖洗3次，每次3 min。顯色：滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察3～10 min，陽性顯色為棕色。自來水沖洗終止顯色，沖洗5 min。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核：蘇木精復(fù)染5 min；自來水沖洗1 min。鹽酸乙醇分化30 s。流水沖洗充分返藍(lán)。切片通過梯度乙醇脫水：80%乙醇5 min，95%乙醇5 min，無水乙醇Ⅰ5 min，無水乙醇Ⅱ5 min。二甲苯：二甲苯液體Ⅰ透明5 min，二甲苯液體Ⅱ透明5 min。中性樹膠封固，顯微鏡下觀察并分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用圖像分析儀（Quanti met 570c，Leica，Germany）采集圖像。采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用LSD法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

光鏡下腎上腺素α1、α2受體免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈淡黃色或棕黃色顆粒染色，散在分布于3組大鼠下丘腦視前區(qū)。免疫組化顯示，OVX組大鼠下丘腦視前區(qū)腎上腺素α1受體陽性黃染顆粒細(xì)胞數(shù)低于假手術(shù)組（P＜0.01），α2受體細(xì)胞數(shù)高于假手術(shù)組；（OVX+E2）組α1受體細(xì)胞數(shù)高于OVX組（P＜0.01），α2受體細(xì)胞數(shù)低于OVX組（P＜0.01）；而（OVX+E2）組與假手術(shù)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1，圖1。

表1 腎上腺素α1受體和腎上腺素α2受體在3組大鼠下丘腦視前區(qū)表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)量（個/100μm2）Table 1 1 Number of positive cells expressing adrenergic α1and α2receptor in POAH of three groups of rats（cells/100μm2）

圖1 大鼠下丘腦視前區(qū)腎上腺素α1受體和α2受體表達(dá)（免疫組化染色×200）Figure 1 Expression of adrenergic α2and α2receptor in POAH of three groups of rats（immunohistochemical×200）

3 討 論

圍絕經(jīng)期潮熱是以潮紅和出汗為特征的快速和夸張的散熱反應(yīng)［4］。中心體溫的微小上升即可觸發(fā)潮熱發(fā)生［14］。它不僅僅是圍絕經(jīng)期的典型癥狀而且可能是其他慢性疾病的征兆［15］。因此，了解潮熱發(fā)生的機(jī)制，對處理緩解圍絕經(jīng)期潮熱癥狀和改善圍絕經(jīng)期婦女們的生活質(zhì)量以及預(yù)防其他疾病有重要意義。

潮熱的發(fā)生可以理解為熱敏感神經(jīng)元在發(fā)揮著重要作用。潮熱發(fā)生時，熱敏感神經(jīng)元發(fā)放沖動到體溫調(diào)節(jié)中樞，由溫度敏感神經(jīng)元整合信息后發(fā)出散熱信號，外周皮膚血管舒張血流量增加，機(jī)體可感覺烘熱，外周血管擴(kuò)張潮紅，皮溫升高出汗，而隨后體溫下降低于調(diào)定點水平，則中樞發(fā)出整合信息，引起產(chǎn)熱增加，表現(xiàn)為發(fā)冷寒戰(zhàn)的升溫過程。體內(nèi)雌激素水平的快速跌落，通過影響中樞神經(jīng)遞質(zhì)（腎上腺素能受體，5-HT受體等）改變下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞體溫調(diào)定點正常生理調(diào)節(jié)機(jī)制，使其對于外圍體溫改變的反饋調(diào)節(jié)紊亂，使血管擴(kuò)張散熱，誘發(fā)潮熱。圍絕經(jīng)期或去卵巢后體內(nèi)雌激素水平下降，而雌激素治療可緩解癥狀，因此可以理解為潮熱可能是低雌激素狀態(tài)下，POAH神經(jīng)元溫度敏感性增高引起的。

去甲腎上腺素是降低體溫調(diào)定點和觸發(fā)潮熱的重要神經(jīng)遞。它通過抑制下丘腦體溫體溫調(diào)節(jié)中樞的熱敏神經(jīng)元或者興奮冷敏神經(jīng)元，導(dǎo)致產(chǎn)熱過多或者散熱不足，使體溫上升［16］。尸體研究表明，大多數(shù)α2受體在人腦中是抑制性受體［17］。向下丘腦視前區(qū)注射α1受體拮抗劑哌唑嗪后，冷、熱敏神經(jīng)元的放電頻率發(fā)生改變［18］。雌激素對腎上腺素受體具有調(diào)節(jié)作用［9，19-20］。綜合這些現(xiàn)象進(jìn)一步證明，圍絕經(jīng)期潮熱發(fā)生的可能機(jī)制是卵巢功能衰竭，雌激素分泌迅速減少，腦內(nèi)去甲腎上腺素升高，最終下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞的熱中性帶變窄。去甲腎上腺素介導(dǎo)的熱中性帶變窄可能通過其相應(yīng)的受體變化引起的。

本研究通過免疫組化方法觀察了與體溫調(diào)節(jié)關(guān)系密切的腎上腺素α1受體和α2受體在去卵巢大鼠下丘腦視前區(qū)的分布變化以及臨床上治療潮熱最有效的雌激素類藥物——戊酸雌二醇干預(yù)后該受體在大鼠下丘腦視前區(qū)的表達(dá)變化，試圖闡明圍絕經(jīng)期潮熱發(fā)生時體溫調(diào)節(jié)紊亂所涉及的去甲腎上腺素通路機(jī)制。去甲腎上腺素對α2受體有高親和性，而對α1受體和β受體的親和性較低；它對體溫調(diào)節(jié)中樞的溫敏神經(jīng)元放電活動的作用主要是由α1受體介導(dǎo)。

本研究觀察到，去卵巢大鼠下丘腦視前區(qū)的腎上腺素α1受體減少，腎上腺素α2受體增多。我們推測，腎上腺素α1受體和腎上腺素α2受體均分布在熱敏神經(jīng)元上，腎上腺素α2受體改變熱敏神經(jīng)元對去甲腎上腺素反應(yīng)的類型，導(dǎo)致散熱不足或者過度散熱。腎上腺素α1受體改變熱敏神經(jīng)元的放電活動，即改變熱敏神經(jīng)元的溫度敏感性。當(dāng)去卵巢大鼠POAH表達(dá)的腎上腺素α2受體增多，熱敏神經(jīng)元表現(xiàn)出受去甲腎上腺素抑制作用的類型為主，導(dǎo)致散熱不足，體溫升高。所以潮熱發(fā)生前中心體溫升高的現(xiàn)象不難解釋，也表明腎上腺素α2受體與潮熱的啟動有關(guān)。去卵巢大鼠POAH表達(dá)的腎上腺素α1受體減少，熱敏神經(jīng)元放電活動減低，溫度敏感性下降，導(dǎo)致散熱機(jī)能減弱，出現(xiàn)體溫調(diào)節(jié)異常。

戊酸雌二醇治療后大鼠POAH區(qū)表達(dá)的上述兩種受體發(fā)生了與OVX大鼠相反的結(jié)果。表明戊酸雌二醇治療潮熱癥狀的部分機(jī)制也是通過腎上腺素能受體完成的。有研究表明，雌激素撤退可致散熱效應(yīng)器的神經(jīng)通路的敏感性增加，雌激素治療去卵巢大鼠后熱中性帶會發(fā)生變化［5，21］。

結(jié)合本研究的結(jié)果，雌激素可能通過腎上腺素能受體直接或間接改變體溫調(diào)節(jié)中樞的熱中性帶。α2受體激動劑可樂可以減少潮熱發(fā)生的次數(shù)，并且增加了需要啟動潮熱的最高溫度，說明α2受體提高了熱閾值并且與潮熱的啟動有關(guān)。Karkanias等［22］發(fā)現(xiàn)切除卵巢后，雌性大鼠POAH神經(jīng)元去甲腎上腺素α2受體的數(shù)量明顯增加，而受體的親和力不變。本研究結(jié)果與之基本一致。圍絕經(jīng)期婦女下丘腦視前區(qū)熱中性帶變窄很可能是由于腎上腺素α2受體數(shù)量增多引起的，換言之，大鼠去卵巢后，腎上腺素α2受體可以使熱中性帶的熱閾值下降，導(dǎo)致熱中性帶變窄。腎上腺素α1受體降低POAH熱敏神經(jīng)元的溫度敏感性，實現(xiàn)腎上腺素α2受體對熱敏神經(jīng)元功能的抑制。二者的作用相輔相成，使下丘腦視前區(qū)體溫調(diào)節(jié)功能紊亂，主要是散熱機(jī)制異常，導(dǎo)致潮熱的發(fā)生。

我們前期工作觀察了去卵巢大鼠下丘腦視前區(qū)與體溫調(diào)節(jié)關(guān)系密切的5-HT受體的分布變化［9］。結(jié)合本次研究結(jié)果，進(jìn)一步表明5-HT和去甲腎上腺素系統(tǒng)在圍絕經(jīng)期潮熱發(fā)生中均扮演重要角色，這兩種神經(jīng)遞質(zhì)包括單胺類神經(jīng)遞質(zhì)間形成復(fù)雜的神經(jīng)遞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，對體溫進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。圍絕經(jīng)期潮熱發(fā)生的中樞神經(jīng)遞質(zhì)機(jī)制比較復(fù)雜，其確切機(jī)制尚需要進(jìn)一步深入研究。