聯(lián)用超高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)扶正化瘀膠囊化學(xué)成分快速鑒別

陶朝陽(yáng)，邢心睿，陳 思，曹 奇，丁德英，朱臻宇

(1.西藏軍區(qū)總醫(yī)院藥物制劑研究中心，西藏 拉薩 8500071；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；3.解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116000)

扶正化瘀膠囊(舊名肝平膠囊、扶正化瘀方、319方)是由上海中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)過20余年研究，采用現(xiàn)代技術(shù)自主研發(fā)生產(chǎn)的復(fù)方中成藥，該方由丹參、桃仁、五味子、冬蟲夏草、絞股藍(lán)、松花粉六味藥材組成，丹參在方中活血祛瘀作為君藥；冬蟲夏草補(bǔ)虛損、益精氣，桃仁助丹參活血祛瘀，共為臣藥；松花粉益氣潤(rùn)燥，絞股藍(lán)清熱解毒，共為佐藥；五味子味酸，為引經(jīng)使藥[3-4,10,16]。該藥針對(duì)肝纖維化血瘀研制，臨床治療效果顯著，是國(guó)家“八五”科技攻關(guān)成果，受國(guó)家發(fā)明專利保護(hù)，已獲得國(guó)家中藥Ⅲ類新藥證書。扶正化瘀片于2006年通過美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局審批，免于Ⅰ期臨床，直接進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)；2013年該復(fù)方圓滿完成Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，使扶正化瘀片成為肝病領(lǐng)域第一個(gè)通過美國(guó)Ⅱ期臨床試驗(yàn)的中成藥，也有望成為首個(gè)獲準(zhǔn)進(jìn)入美國(guó)主流醫(yī)藥市場(chǎng)的復(fù)方中藥。

該復(fù)方在我國(guó)已使用多年，但由于其組分復(fù)雜，一直缺乏系統(tǒng)性研究，盡管目前關(guān)于該復(fù)方作用機(jī)制的報(bào)道較多[1-2,5-8]，但是整個(gè)復(fù)方的化學(xué)成分還未見報(bào)道。因此，明確扶正化瘀膠囊各個(gè)組分的化學(xué)成分對(duì)于深入研究該復(fù)方治療效果、闡明各個(gè)組分發(fā)揮作用的機(jī)制療效具有重要意義。

UHPLC和Q-TOF/MS的串聯(lián)技術(shù)在中藥復(fù)方等復(fù)雜體系研究中占有一定優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)集色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏、高分辨、強(qiáng)定性能力于一體，已經(jīng)成為中藥復(fù)方化學(xué)成分分析和鑒定的有效手段之一[12-14]。本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-QTOF/MS技術(shù)首次對(duì)扶正化瘀膠囊中的化學(xué)成分進(jìn)行快速分析，并對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行藥材歸屬，進(jìn)一步闡明了扶正化瘀膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity 液相系統(tǒng)，包括G4220A四元泵、G4226自動(dòng)進(jìn)樣器G1316C柱溫箱(安捷倫科技有限公司，美國(guó))；Agilent 6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)及MassHunter Qualitative Analysis Software 分析工作站(安捷倫科技有限公司，江蘇南京)；JY10001十萬(wàn)分之一電子天平(精密科學(xué)儀器有限公司，上海)；Heal Force SMART-N 超純水機(jī)(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，香港)；Micro 17高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))；甲醇、乙腈均為色譜純(Merck，德國(guó))，甲酸為色譜級(jí)(ROE scientific INC，美國(guó))，水為實(shí)驗(yàn)室制備的超純水，其他試劑均為分析級(jí)。

1.2 藥品與試劑

丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、丹酚酸A、丹參酮ⅡA、苦杏仁苷、腺苷、蟲草素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子酯甲、山柰酚對(duì)照品(一飛生物科技有限公司，上海，純度≥98%)。扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥有限責(zé)任公司)購(gòu)自益豐大藥房，批號(hào)：161220、170640、171116。

1.3 對(duì)照品溶液制備

分別用毛細(xì)管蘸取約0.1 mg的丹酚酸B、二氫丹參酮I、丹酚酸A、丹參酮ⅡA、苦杏仁苷、蟲草素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子酯甲、山柰酚對(duì)照品置于200 μl的甲醇溶液中制成對(duì)照品混合溶液。

1.4 供試品溶液制備

精密稱取扶正化瘀膠囊內(nèi)容物0.5 g，置于25 ml棕色具塞量瓶中，加入25 ml甲醇適量溶解，超聲(功率：300 W，頻率：40 kHz)處理60 min，補(bǔ)足減失的甲醇，室溫放置20 min，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液于離心管中，于16 000 r/min離心10 min，取上清液，即得扶正化瘀膠囊樣品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCHSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters Corporation，Ireland)。流動(dòng)相采用0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)。梯度洗脫條件：0～3 min，2%B；3～18 min，2%～50%B；18～22 min，50%～95% B；22～25 min，95%B。平衡時(shí)間為10 min，流速為0.4 ml/min，分析所用時(shí)間為25 min。進(jìn)樣體積設(shè)置為3 μl，柱溫箱溫度為40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器的溫度為4 ℃。

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源采用正/負(fù)離子模式。正離子模式條件：毛細(xì)管電壓4 V；干燥氣體流速11 L/min；干燥氣體溫度350 ℃；霧化器壓力45 psig；碎片電壓120 V；Skimmer電壓60 V。質(zhì)譜采集范圍100～1 100m/z，參比離子m/z為121.0509。

1.7 扶正化瘀膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)的建立

根據(jù)國(guó)內(nèi)外已有的專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)TCM@taiwan、TCMID(traditional Chinese medicine integrative database)和上海中科院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)研究文獻(xiàn)，共收集了扶正化瘀膠囊六味藥材中801個(gè)化學(xué)成分。利用Agilent公司研發(fā)的Formula-Database-Generator軟件，通過各化學(xué)成分包含碳、氫、氧的個(gè)數(shù)，計(jì)算化合物精確的相對(duì)分子質(zhì)量，建立化學(xué)成分的分子式和相對(duì)分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件優(yōu)化

對(duì)于樣品提取溶劑，本實(shí)驗(yàn)首先采用了乙腈和甲醇2種提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取樣品的峰容量明顯高于乙腈，而且部分的主峰響應(yīng)也更佳，故放棄了使用乙腈溶劑的提取方法。

關(guān)于色譜條件考察，本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水和乙腈-水，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乙腈-水的洗脫系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水，而且各峰之間的分離效果更好。加入0.1%的甲酸可以提高峰響應(yīng)，還可以改善峰拖尾，因此采用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液的洗脫系統(tǒng)。

2.2 扶正化瘀膠囊總離子流圖

精密吸取扶正化瘀膠囊供試品溶液和對(duì)照品混合溶液200 μl置進(jìn)樣小瓶，按照上述色譜和質(zhì)譜的測(cè)試條件進(jìn)行樣品分析，得到扶正化瘀方樣品溶液正、負(fù)離子模式下的總離子流圖，如圖1所示。

圖1 扶正化瘀膠囊供試品TOF/MS總離子流圖 A.正離子模式；B.負(fù)離子模式1.丹酚酸B；2.二氫丹參酮I；3.丹酚酸A；4.丹參酮ⅡA；5.苦杏仁苷；6.蟲草素；7.五味子醇甲；8.五味子乙素；9.五味子酯甲；10.山柰酚

2.3 利用對(duì)照品鑒別扶正化瘀膠囊中的化合物

實(shí)驗(yàn)中利用已有的對(duì)照品，無差別鑒別出丹酚酸B(峰1)、二氫丹參酮Ⅰ(峰2)、丹酚酸A(峰3)、丹參酮ⅡA(峰4)、苦杏仁苷(峰5)、蟲草素(峰6)、五味子醇甲(峰7)、五味子乙素(峰8)、五味子酯甲(峰9)、山柰酚(峰10)，對(duì)照品混合溶液正離子模式下的總離子流圖如圖2A，丹參酮ⅡA、二氫丹參酮Ⅰ在扶正化瘀膠囊供試品和對(duì)照品混合溶液正離子模式下提取離子流圖，如圖2B、圖2D和圖2C、圖2E。

2.4 化合物鑒別的方法

以正離子模式下4號(hào)峰丹參酮ⅡA為例介紹扶正化瘀膠囊中色譜峰的鑒別過程。TIC圖中的保留時(shí)間為8.751 min(圖2B)的色譜峰顯示的準(zhǔn)分子離子為295.136 2，利用 Qualiative Analysis 軟件分析工具計(jì)算精確質(zhì)量數(shù)的可能的元素組成(<5 ppm)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中已知化合物的質(zhì)荷比，初步確定分子式為 C19H18O3。通過計(jì)算該準(zhǔn)分子離子的核素分布情況，從圖3A可以看出同位素分布的理論值與實(shí)際值恰好吻合，確定此峰為丹參酮ⅡA。同理可得該模式下2號(hào)峰二氫丹參酮Ⅰ的解析過程，如圖3B。

2.5 扶正化瘀膠囊中化學(xué)成分的鑒別結(jié)果

根據(jù)飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)得的精確的相對(duì)分子質(zhì)量，比對(duì)所建的扶正化瘀膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用 Qualiative Analysis質(zhì)譜分析軟件計(jì)算分子組成，將理論值與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合上述對(duì)照品鑒別結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9,11,15]，對(duì)扶正化瘀膠囊在正/負(fù)離子模式下所得色譜圖中色譜峰分析，在正離子模式下初步鑒別 出 115個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見表1。在負(fù)離子模式下初步鑒別出66個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見表2。其中，正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)的有 28個(gè)(表中標(biāo)#)。對(duì)于部分為未區(qū)分的同分異構(gòu)體，后期可考慮調(diào)節(jié)碎片電壓得到化合物的裂解規(guī)律進(jìn)而區(qū)分。對(duì)于化學(xué)成分的藥材歸屬，由表1和表2可見，對(duì)于峰容量較大和響應(yīng)強(qiáng)度較高的化學(xué)成分主要集中于君藥丹參，臣藥冬蟲夏草和桃仁，符合中藥復(fù)方配伍原則。

圖2 扶正化瘀膠囊供試品、對(duì)照品溶液的總離子流圖和提取離子流圖 A.對(duì)照品混合溶液正離子模式下總離子流圖；B.扶正化瘀膠囊供試品溶液對(duì)丹參酮ⅡA提取離子流圖；C.對(duì)照品混合溶液對(duì)丹參酮ⅡA提取離子流圖；D.扶正化瘀膠囊供試品溶液對(duì)二氫丹參酮Ⅰ提取離子流圖；E.對(duì)照品混合溶液對(duì)二氫丹參酮Ⅰ提取離子流圖1.丹酚酸B；2.二氫丹參酮Ⅰ；3.丹酚酸A；4.丹參酮ⅡA；5.苦杏仁苷；6.蟲草素；7.五味子醇甲；8.五味子乙素；9.五味子酯甲；10.山柰酚

圖3 正離子模式下化合物準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量及同位素分布圖 A.丹參酮ⅡA；B.二氫丹參酮Ⅰ

編號(hào)保留時(shí)間(t/min)化合物名稱化學(xué)式M+X理論分子量(m/z)實(shí)際分子量(m/z)誤差(/10-6)歸屬藥材C11.118ferulicacidC10H10O4(M+H)+195.0665195.0658-1SalviamiltiorrhizaBge.C21.693ziganeinC15H10O4(M+H)+255.0667255.0650.42SalviamiltiorrhizaBge.C36.615dihydrokaranoneC15H22O(M+H)+219.174219.17420.28SalviamiltiorrhizaBge.C43.229dihydronortanshinoneC17H14O4(M+H)+283.0968283.0972-2.31SalviamiltiorrhizaBge.C56.713danshenspiroketallactoneC17H16O3(M+H)+269.1172269.1173-1.74SalviamiltiorrhizaBge.C67.264isotanshinoneIC18H12O3(M+H)+277.0861277.0866-2.26SalviamiltiorrhizaBge.C73.139monodydroxytanshinoneIC18H12O4(M+H)+293.0811293.08051.3SalviamiltiorrhizaBge.C81.266salvianolicacidG#C18H12O7(M+H)+341.0657341.06530.05SalviamiltiorrhizaBge.C97.847dihydrodanshinoneI?C18H14O3(M+H)+279.102279.1018-0.04SalviamiltiorrhizaBge.C105.5223-hydroxymethylenetanshin-quinoneC18H14O4(M+H)+295.0969295.0962-1.31SalviamiltiorrhizaBge.C117.617miltironeIC18H16O2(M+H)+265.1223265.12171.78SalviamiltiorrhizaBge.C126.1381,2,15,16-tetrahydrotanshi-noneIC18H16O3(M+H)+281.1172281.11670.99SalviamiltiorrhizaBge.C134.84(+-)-danshexinkunAC18H16O4(M+H)+297.1124297.1122-1.94SalviamiltiorrhizaBge.C142.35kaempferol?#C18H16O5(M+H)+313.1083313.10681.36SalviamiltiorrhizaBge.C155.3174-methylenemiltironeC18H18O2(M+H)+267.1383267.1382-0.16SalviamiltiorrhizaBge.C161.2ttanshindiolBC18H18O5(M+H)+315.1206315.1221-0.53SalviamiltiorrhizaBge.C179.138salvinoneC18H20O2(M+H)+269.1539269.1537-2.67SalviamiltiorrhizaBge.

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

注：*已通過對(duì)照品鑒別；#均經(jīng)正、負(fù)離子模式下鑒別

表2 扶正化瘀膠囊中化學(xué)成分的負(fù)離子模式鑒別

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

注：*已通過對(duì)照品鑒別；#均經(jīng)正、負(fù)離子模式下鑒別

3 結(jié)論

本研究首次運(yùn)用UHPLC-QTOF/MS技術(shù)快速初步鑒別出扶正化瘀膠囊154個(gè)化學(xué)成分，利用已有的標(biāo)準(zhǔn)品已成功鑒別10個(gè)成分，表征了扶正化瘀膠囊的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為其進(jìn)一步的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂及體內(nèi)外藥理研究提供了前提條件，為扶正化瘀膠囊的深入研究奠定良好基礎(chǔ)。