β-葡萄糖苷酶非水相生物合成紅景天苷

張 樂，沙久凱，陳宇彤，閆凱迪，王 華

(南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

紅景天為景天科紅景天屬植物。我國應(yīng)用紅景天很早，在藏醫(yī)《四部醫(yī)典》和《本草綱目》均有記載，紅景天是一種同人參等重要中藥材相媲美的高價(jià)值保健藥源，可入藥，也可做保健品[1]。近年來研究證明紅景天中主要有效成分紅景天苷具有抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用。

目前主要從植物體中提取獲得紅景天苷，但是植物體中的含量很低，雖然蘇波等[2]對(duì)紅景天苷提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，收率并不高，故人們開始探尋新方法以高效合成紅景天苷。另外還有利用化學(xué)方法合成和愈傷組織培養(yǎng)合成[3]。化學(xué)方法合成是以葡萄糖為主要原料合成、以對(duì)羥基苯甲醛或?qū)αu基苯乙酸為主要原料合成、以對(duì)氨基苯乙醇或?qū)αu基苯乙醇為主要原料合成。化學(xué)合成法具有收率和純度都很高、反應(yīng)快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但大多合成路線需要對(duì)基團(tuán)進(jìn)行選擇性保護(hù)或使用昂貴的金屬催化劑，所用的一些催化劑和試劑易污染環(huán)境，而且其立體選擇性差。愈傷組織培養(yǎng)合成是以紅景天莖、葉及種子萌發(fā)的子葉等為外植體誘導(dǎo)而成的愈傷組織進(jìn)而合成紅景天苷。酶法合成紅景天苷因具有選擇性高、產(chǎn)物純度較高、便于分離純化等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[4]。

本文在非水相介質(zhì)中以β-葡萄糖苷酶催化逆水解反應(yīng)合成紅景天苷，為高效制備紅景天苷提供新思路。

1 材料

1.1 試劑

β-葡萄糖苷酶，上海金穗生物科技有限公司；紅景天苷對(duì)照品(≥98% HPLC)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

HH-W0-5L智控升降油??；SHZ-DⅢ循環(huán)水式多用真空泵；WT10002K電子分析天平；SHA-B恒溫振蕩器；80-2臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)；RE52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；UV-2450紫外分光光度計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酶促合成反應(yīng)步驟

在25 mL具塞錐形瓶中，取酪醇、D-葡萄糖混溶于10 mL乙腈/緩沖液(pH值=4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液：醋酸鈉18 g，冰醋酸9.8 mL，加水稀釋至1000 mL)，加入50 mg的β-葡萄糖苷酶粉，于40℃恒溫震蕩反應(yīng)48 h。取反應(yīng)液，用80-2臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)離心20 min(轉(zhuǎn)速2000 r/min)，除去殘?jiān)?，得澄清溶液，向其中加入正丁醇約20 mL進(jìn)行多次萃取，合并萃取液，旋蒸，得濃縮液，測(cè)定濃縮液體積，并通過分光光度法檢測(cè)其吸光度。

2.2 紅景天苷含量的測(cè)定

根據(jù)董彥莉等[5]對(duì)紅景天中所含紅景天苷含量測(cè)定方法的研究中選擇紫外分光光度法，選定的檢測(cè)波長為230 nm。以吸光值為縱坐標(biāo)，以紅景天苷濃度為橫坐標(biāo)，作紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。

圖1 紅景天苷的紫外吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ultraviolet absorbance of salidroside

3 催化條件的優(yōu)化

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 酪醇濃度對(duì)紅景天苷合成的影響

在葡萄糖的濃度為2.5%，40℃，80%乙腈反應(yīng)體系中，搖床酶促反應(yīng)48 h，研究酪醇濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%時(shí)，對(duì)紅景天苷合成的影響，見圖2。

圖2 酪醇濃度對(duì)紅景天苷合成的影響Fig.2 Effect of tyrosol concentration on salidroside synthesis

從圖2可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著酪醇濃度的不斷增加，紅景天苷的轉(zhuǎn)化率也不斷增加，當(dāng)酪醇起始濃度為8%時(shí)，紅景天苷的轉(zhuǎn)化率最大，而后又開始下降。分析可知，底物濃度過大，在一定條件下抑制了β-葡萄糖苷酶的催化活性，使酶活下降，從而使紅景天苷產(chǎn)率降低。

3.1.2 葡萄糖濃度對(duì)紅景天苷合成的影響

在酪醇的濃度為8%，40℃，80%乙腈反應(yīng)體系中，搖床酶促反應(yīng)48 h，研究葡萄糖濃度分別為1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%時(shí)，對(duì)紅景天苷合成的影響，見圖3。

圖3 葡萄糖濃度對(duì)紅景天苷合成的影響Fig.3 Effect of slucose concentration on salidroside synthesis

從圖3可以看出，在其它條件不變的條件下，紅景天苷的轉(zhuǎn)化率隨當(dāng)葡萄糖濃度先增加后又降低，在葡糖糖濃度為2.5%時(shí)取得最大值。分析可知，這可能是因?yàn)槠咸烟菨舛冗^高，在80%乙腈反應(yīng)體系中未完全溶解，另外還有底物抑制效應(yīng)，使得紅景天苷轉(zhuǎn)化率降低。

3.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)紅景天苷合成的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)紅景天苷合成的影響Fig.4 Effect of reaction time on salidroside synthesis

在葡萄糖濃度為2.5%，酪醇的濃度為8%，40℃，80%乙腈反應(yīng)體系中，搖床酶促反應(yīng)48 h，研究反應(yīng)時(shí)間分別為12、24、48、72、96、120 h時(shí)，對(duì)紅景天苷合成的影響，見圖4。

從圖4可以看出，在其它條件不變的條件下，在12～72 h內(nèi)紅景天苷的轉(zhuǎn)化率率隨著時(shí)間的延長而增加，到達(dá)72 h時(shí)紅景天苷的轉(zhuǎn)化率率達(dá)到最大值。但是當(dāng)時(shí)間超過72 h后，紅景天苷的轉(zhuǎn)化率率有所下降。分析可知，可能是由于時(shí)間的延長，紅景天苷提取液中的其他無效成分的溶出，從而影響了有效成分之紅景天苷的釋放，同時(shí)，β-葡萄糖苷酶在有機(jī)溶劑中時(shí)間過長導(dǎo)致酶活性降低從而使轉(zhuǎn)化率降低[6]。

3.1.4 乙腈濃度對(duì)紅景天苷合成的影響

在葡萄糖的濃度為2.5%，酪醇濃度為8%，40℃，搖床酶促反應(yīng)48 h，研究乙腈濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%時(shí)，對(duì)紅景天苷合成的影響，見圖5。

圖5 乙腈濃度對(duì)紅景天苷合成的影響Fig.5 Effect of acetonitrile concentration on synthesis of salidroside

從圖5可以看出，在其它條件不變的條件下，隨著乙腈濃度增加，轉(zhuǎn)化率增加，直至乙腈濃度達(dá)到80%，轉(zhuǎn)化率最高，接著開始降低。分析可知，因?yàn)樗诌^多，產(chǎn)物極易發(fā)生水解反應(yīng)[7]，所以紅景天苷的轉(zhuǎn)化率較低，而在適當(dāng)濃度的有機(jī)溶劑中，水解反應(yīng)會(huì)受到一定的抑制，所以轉(zhuǎn)化率較高。

3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)酪醇濃度、葡萄糖濃度、乙腈濃度、反應(yīng)時(shí)間四個(gè)因素，確定如表1的L9(43)的正交試驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Table of factors and levels for orthogonal test

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表2(續(xù))

從表2對(duì)紅景天苷轉(zhuǎn)化率的極差分析來看，四個(gè)因素對(duì)紅景天苷轉(zhuǎn)化率影響水平的強(qiáng)弱為A>B>C>D，即轉(zhuǎn)化率的最大影響因素為葡萄糖濃度，最小的影響因素是反應(yīng)時(shí)間；最佳水平組合為A1B2C2D2，即實(shí)驗(yàn)2，轉(zhuǎn)化率最高，為16.98%。

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步確認(rèn)最佳優(yōu)化組合A1B2C2D2是否能夠達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，此時(shí)，紅景天苷的轉(zhuǎn)化率分別為16.34%、15.93%、17.01%，平均轉(zhuǎn)化率為16.43%，該結(jié)果顯示紅景天苷的轉(zhuǎn)化率較高且較穩(wěn)定。通過該驗(yàn)證試驗(yàn)可以進(jìn)一步的說明該種提取工藝可以達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。

4 結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)研究了各單因素之間的相互影響，優(yōu)化了合成紅景天苷的工藝，并確定了最佳的工藝參數(shù)：酪醇濃度8%，葡萄糖濃度2.5%，乙腈濃度為80%，40℃下反應(yīng)72 h，此時(shí)紅景天苷的轉(zhuǎn)化率為16.43%。與Hiroyuki Akita等[8]提取的β-葡萄糖苷酶催化合成紅景天苷的產(chǎn)量相比，其產(chǎn)率為11%，本文優(yōu)化的工藝條件下，酶法合成紅景天苷的產(chǎn)率得到了較大幅度的提高，可促進(jìn)實(shí)現(xiàn)綠色、高效制備紅景天苷的目標(biāo)。