糖基化反應(yīng)對(duì)乳清蛋白-巖藻多糖共聚物抗氧化性能的影響

艾正文，于 鵬

（光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436）

乳清蛋白是一種重要的蛋白質(zhì)，含有大量人體必需氨基酸且易于消化吸收，因此被認(rèn)為是人體補(bǔ)充優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源之一，成為各國(guó)的研究熱點(diǎn)。其中，通過對(duì)乳清蛋白進(jìn)行物理、化學(xué)或生物改性，進(jìn)而改變?nèi)榍宓鞍椎哪承┕δ芴匦缘膱?bào)道不斷涌現(xiàn)。

在一定條件下，蛋白質(zhì)和碳水化合物之間可以發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，糖基化反應(yīng)是一種重要的化學(xué)反應(yīng)。在食品加工過程中，糖基化反應(yīng)普遍發(fā)生在加熱或產(chǎn)品貯藏過程中。目前，有研究表明，某些糖基化產(chǎn)物具有一定的生物活性[1]。相較于其他蛋白質(zhì)改性方法，糖基化反應(yīng)具有安全、綠色等優(yōu)勢(shì)，因此受到各國(guó)研究人員的青睞

[2]。早在20世紀(jì)50年代就有糖基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能的有關(guān)研究報(bào)道。研究表明，某些糖基化產(chǎn)物（類黑精、雜環(huán)化合物等）具有一定的抗氧化活性[3]。Liu Qian等[4]研究表明，蛋白質(zhì)與葡萄糖經(jīng)過糖基化反應(yīng)后得到的糖基化產(chǎn)物與未反應(yīng)前的蛋白質(zhì)相比，其抗氧化能力顯著增加。

乳清蛋白糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的功能特性與糖基化過程中的碳水化合物種類密切相關(guān)。目前，關(guān)于乳清蛋白糖基化產(chǎn)物的抗氧化研究已陸續(xù)有研究報(bào)道[5]。其中，以乳清蛋白與葡萄糖、果糖、麥芽糊精和核糖等碳水化合物的糖基化產(chǎn)物抗氧化性研究居多[6-7]。巖藻多糖作為一種含有硫酸基的大分子多聚糖，由于其潛在的抗氧化、提升免疫力等多種生物活性，最近幾年逐漸成為研究熱點(diǎn)。然而，目前乳清蛋白與巖藻多糖糖基化產(chǎn)物抗氧化性能的研究仍鮮有報(bào)道。本研究通過干法糖基化研究不同比例的乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的抗氧化性能，從而揭示蛋白質(zhì)和多糖比例以及糖基化反應(yīng)時(shí)間對(duì)最終產(chǎn)物抗氧化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白BiPRO?（純度≥90%） 美國(guó)安格普有限公司；巖藻多糖 北京雷力聯(lián)合海洋生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 東京仁成工業(yè)株式會(huì)社；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ML-T分析天平、FiveGo F2 pH計(jì) 瑞士梅特勒-特利多公司；HPP110恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國(guó)Memmert公司；SP-752紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FreeZone真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司。

1.3 方法

巖藻多糖含量的測(cè)定主要參考SC/T 3404—2012《巖藻多糖》[8]所述方法。稱取0.1 g巖藻多糖樣品于試管中，加入10 mL 4 mol/L三氟乙酸充分混勻，置于110 ℃干燥箱中水解2 h，冷卻至室溫；加入NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性，用0.1 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液定容備用；將獲得的水解液用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮進(jìn)行衍生化，然后將衍生化后的樣品過膜后進(jìn)行高效液相色譜分析。流動(dòng)相A：15%乙腈和85% 0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液；流動(dòng)相B：40%乙腈和60% 0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液；梯度洗脫；250 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。含量的測(cè)定采用BaCl2沉淀法，方法參考Dodgson[9]和SC/T 3404—2012[8]所述方法，并稍作修改。稱取適量巖藻多糖樣品，加入1 mol/L鹽酸，在100 ℃條件下水解4 h，水解液用濾紙過濾；將得到的過濾液煮沸1 min后逐漸加入適量10 g/100 mL BaCl2后再煮沸4 min，最后記錄沉淀物的質(zhì)量，根據(jù)式（1）計(jì)算的含量。

式中：m1為樣品的質(zhì)量/g；m2為無水BaSO4質(zhì)量/g；的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；233.39為BaSO4的摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

1.3.2 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的制備

首先將乳清蛋白和巖藻多糖按照一定質(zhì)量比溶于蒸餾水中，用乳酸調(diào)節(jié)至pH 6，然后充分混合均勻后將混合液置于超低溫冰箱中凍存12 h，隨后將冷凍后的乳清蛋白-巖藻多糖混合液放入凍干機(jī)中凍干48 h，制得的乳清蛋白-巖藻多糖凍干粉留存?zhèn)溆谩?/p>

稱取2 g乳清蛋白-巖藻多糖凍干粉，平鋪于培養(yǎng)皿中，然后置于相對(duì)濕度79%、溫度55 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行糖基化反應(yīng)，從而獲得乳清蛋白-巖藻多糖共聚物。

1.3.3 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物褐變程度的測(cè)定

參考Corzo-Martínez等[10]的方法，并略作修改。精確稱量0.1 g不同反應(yīng)時(shí)間段的乳清蛋白-巖藻多糖共聚物，用去離子水溶解后定容至100 mL，分別在294、420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A），若吸光度超過1.5，可對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.3.4 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物DPPH自由基清除能力測(cè)定

稱取1.3.2節(jié)不同反應(yīng)時(shí)間段獲得的乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物，用去離子水混合均勻后定容至25 mL，配制成質(zhì)量濃度4 mg/mL的溶液；隨后取2 mL與2 mL 0.1 mmol/L DPPH混勻，放置于37 ℃暗室培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min；最后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。同時(shí)，取適量VC，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的VC水溶液，在相同條件下測(cè)定DPPH自由基清除率，作為對(duì)照。根據(jù)式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為樣品和0.1 mmol/L DPPH混合液（1∶1，V/V）的吸光度；At為樣品和無水乙醇混合液（1∶1，V/V）的吸光度；A0為無水乙醇和0.1 mmol/L DPPH混合液（1∶1，V/V）的吸光度。

1.3.5 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物還原能力測(cè)定

稱取1.3.2節(jié)不同反應(yīng)時(shí)間段獲得的乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物，用去離子水混合均勻后定容至25 mL，配制成質(zhì)量濃度4 mg/mL的溶液。還原能力測(cè)定參考張加幸等[11]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Origin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻多糖樣品的巖藻多糖和含量

本研究使用的巖藻多糖樣品是通過水提方法從海帶（Laminaria japonica）中提取獲得的。經(jīng)高效液相色譜和BaCl2沉淀法對(duì)樣品中的巖藻多糖和含量分別進(jìn)行測(cè)定。

表 1 巖藻多糖樣品中巖藻多糖和含量及pH值Table 1 pH value, purity and content of fucoidan

表 1 巖藻多糖樣品中巖藻多糖和含量及pH值Table 1 pH value, purity and content of fucoidan

注：*.巖藻多糖水溶液質(zhì)量濃度為1 g/100 mL。

2-含量/% pH*測(cè)定結(jié)果 85.6 24.5 6.45指標(biāo) 巖藻多糖含量/% SO4

2.2 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的褐變程度

隨著糖基化反應(yīng)進(jìn)程的進(jìn)行，反應(yīng)體系的顏色會(huì)發(fā)生不同程度的改變，通過對(duì)糖基化反應(yīng)過程中早期階段產(chǎn)物（A294nm）和高級(jí)階段產(chǎn)物（A420nm）的吸光度進(jìn)行測(cè)定，可以反映體系的褐變程度，進(jìn)而得知糖基化反應(yīng)的進(jìn)程[12]。

表 2 乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的褐變程度（n=3）Table 2 Degree of browning in glycosylated whey protein with fucoidan (n= 3)

由表2可知，大部分樣品隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其褐變程度總體上呈逐漸增加趨勢(shì)，特別在反應(yīng)前期階段（60 h），褐變程度呈現(xiàn)顯著增加（P＜0.05）。在294 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)時(shí)，乳清蛋白與巖藻多糖質(zhì)量比為1∶2時(shí)，糖基化產(chǎn)物的褐變程度（A294nm）從0 h時(shí)的1.040顯著增加到90 h的1.417（P＜0.05）；乳清蛋白與巖藻多糖質(zhì)量比為3∶1時(shí)，糖基化產(chǎn)物的A294nm在80 h時(shí)達(dá)到最大，隨后在反應(yīng)到90 h時(shí)有輕微下降。同樣，在420 nm波長(zhǎng)條件下，糖基化反應(yīng)時(shí)間能夠顯著影響整個(gè)反應(yīng)體系的褐變程度（A420nm），4 組樣品的A420nm從0 h到90 h均增加超過30%，其中前3 組樣品與未反應(yīng)前相比，A420nm增加率超過50%。當(dāng)乳清蛋白與巖藻多糖質(zhì)量比為3∶1時(shí)，樣品在反應(yīng)80 h時(shí)A420nm達(dá)到最大，隨后沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05），這與A294nm的變化趨勢(shì)基本一致。

蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)的非酶促不可逆羰基修飾，一般可分為3 個(gè)過程，即早、中、晚3 個(gè)階段[13]，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，整個(gè)體系的顏色逐漸加深。通過A294nm和A420nm的比值（A294nm/A420nm）可以監(jiān)測(cè)不同階段的糖基化產(chǎn)物對(duì)整個(gè)體系褐變程度的貢獻(xiàn)情況[14]。在相同糖基化條件下，反應(yīng)底物中巖藻多糖含量越低，體系進(jìn)入糖基化進(jìn)程中后期的時(shí)間越早。杜玲玲等[15]研究發(fā)現(xiàn)，褐變程度與蛋白質(zhì)和碳水化合物的接枝度具有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。4 組樣品在420 nm波長(zhǎng)處的吸光度在90 h時(shí)達(dá)到最大，樣品褐變程度達(dá)到最大。此外，與其他組不同的是，第4組樣品60～80 h的A420nm沒有發(fā)生顯著變化。原因一方面可能是底物巖藻多糖比例的增加會(huì)延緩糖基化反應(yīng)的速率；另一方面，可能是由于糖基化早期階段產(chǎn)物在紫外區(qū)間吸收量較低[16]。

2.3 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力

通過對(duì)糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，判斷乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的抗氧化性能。

圖 1 乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力Fig. 1 DPPH radical scavenging activity of the whey protein and fucoidan glycosylation products

由圖1可知，對(duì)于單獨(dú)的乳清蛋白或巖藻多糖底物，在現(xiàn)有的糖基化條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其DPPH自由基清除率無明顯變化（P＞0.05）。在糖基化反應(yīng)開始后，乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率顯著高于單獨(dú)的乳清蛋白或巖藻多糖（P＜0.05），而且隨著反應(yīng)的推進(jìn)，各糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率也基本呈逐漸增加趨勢(shì)。乳清蛋白與巖藻多糖質(zhì)量比為3∶1時(shí)，其糖基化產(chǎn)物在反應(yīng)90 h時(shí)的DPPH自由基清除率相比0 h時(shí)增加超過30%。在相同反應(yīng)條件下，混合反應(yīng)底物中的巖藻多糖含量越高，其糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力相對(duì)越強(qiáng)。當(dāng)乳清蛋白與巖藻多糖質(zhì)量比為1∶3時(shí)，其糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率在反應(yīng)80 h時(shí)達(dá)到最大（74.28%），顯著高于相同時(shí)間下的乳清蛋白（40.68%）和巖藻多糖（51.42%），但是仍低于對(duì)照組（0.01% VC）。研究表明，巖藻多糖分子結(jié)構(gòu)和SO42-基團(tuán)含量對(duì)抗氧化活性有較為明顯的影響[17]，糖基化反應(yīng)產(chǎn)生的蛋白多糖可能會(huì)增強(qiáng)巖藻多糖的抗氧化性能。此外，乳清蛋白與巖藻多糖質(zhì)量比為1∶3時(shí)，其糖基化產(chǎn)物在反應(yīng)90 h時(shí)的DPPH自由基清除率有一個(gè)明顯的下降過程，但是其在90 h時(shí)的A420nm卻顯著增加（表2），由此說明，進(jìn)入糖基化反應(yīng)后期，產(chǎn)物的褐變程度與自由基清除能力不一定呈正比關(guān)系。

2.4 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的還原能力

還原力作為評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化性能的另一個(gè)重要指標(biāo)，通常以該物質(zhì)在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A700nm）表示。A700nm值越大，物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)[18]。

圖 2 乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的還原能力Fig. 2 Reducing power of the whey protein and fucoidan glycosylation products

由圖2可知，乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的還原能力隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加，而當(dāng)反應(yīng)底物中只含有乳清蛋白或巖藻多糖時(shí)，A700nm則隨糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯變化，這說明乳清蛋白和巖藻多糖通過糖基化反應(yīng)能產(chǎn)生具有還原能力的物質(zhì)[19]。這些具有還原能力的物質(zhì)可能來源于糖基化反應(yīng)中后期階段產(chǎn)生的還原性酮和類黑精等物質(zhì)[20]。張加幸等[11]研究表明，巖藻多糖本身具有一定的還原力，這與本研究結(jié)果相符，但是巖藻多糖的還原力與其多糖組成和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。高強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間的糖基化反應(yīng)可能會(huì)破壞其特定結(jié)構(gòu)，從而造成糖基化產(chǎn)物還原力的降低。

3 結(jié) 論

通過干法糖基化制得乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物，并對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間糖基化產(chǎn)物的褐變程度、DPPH自由基清除率及還原力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，糖基化反應(yīng)能顯著提高乳清蛋白和巖藻多糖單體的抗氧化性能，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，糖基化產(chǎn)物的抗氧化性能呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)，但是反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度與DPPH自由基清除率不完全呈正比關(guān)系。同等條件下，反應(yīng)底物中的巖藻多糖含量越高，其糖基化產(chǎn)物的抗氧化性能越強(qiáng)。雖然目前乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產(chǎn)物的抗氧化性仍低于傳統(tǒng)抗氧化物質(zhì)，但是目前的研究仍處于初步階段，其潛在的功能仍具有一定的研究?jī)r(jià)值。