山楂葉總黃酮對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的抑制作用

刁婷婷，張雨晨，呂 偉，閔 清

(1. 湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100; 2. 湖北省咸寧市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 咸寧 437100)

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤，是最常見、最具侵襲性的腦腫瘤[1]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在40～70歲之間發(fā)生率較高，中位生存期為診斷后的12～16個(gè)月。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是腦腫瘤死亡率最高的腫瘤，雖然有手術(shù)、放療、化療、基因治療等多種治療方法, 但因其侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、位置特殊、預(yù)后差, 具有很高的病死率和致殘率, 嚴(yán)重威脅著人類健康[2]。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤逃逸到轉(zhuǎn)移部位是一個(gè)多步驟的過(guò)程，需要細(xì)胞黏附的喪失，并獲得細(xì)胞的遷移和侵襲能力[3]。目前，治療惡性膠質(zhì)瘤成為腫瘤領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)之一[4]，因此，尋找有效的生物靶點(diǎn)，研發(fā)理想的治療藥物尤為迫切。

山楂葉總黃酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)是一種存在山楂葉中的黃酮類化合物，山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅或山楂的干燥葉[5]，由于其資源豐富、價(jià)格低廉，具有廣泛的藥理作用，且低毒安全的特性，近年來(lái)倍受醫(yī)藥研究者的關(guān)注。目前，從山楂葉中分離出的黃酮類化合物已有60余種，黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等功效[6]，具有重要的藥用價(jià)值，成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)已明確HLF在降壓降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化方面具有明顯療效，已應(yīng)用于冠心病、心絞痛、高血壓等心血管疾病的治療[7]，但HLF對(duì)惡性膠質(zhì)瘤治療作用的相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為研究對(duì)象，探討HLF對(duì)U87細(xì)胞增殖、黏附、遷移和侵襲的影響，期望可以更好地利用山楂葉這一豐富低廉的藥用資源，為今后HLF的抗腫瘤臨床應(yīng)用及進(jìn)一步合理開發(fā)其藥用價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑HLF(含量93.5%)，購(gòu)于山東臨沂愛(ài)康藥業(yè)。DMEM高糖培養(yǎng)基、Transwell小室，購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.25%胰蛋白酶，購(gòu)自Gibco公司；Matrigel膠，購(gòu)自Corning公司；二甲基亞砜(dimethyl-sulfoxid,DMSO)，購(gòu)自Sigma公司；CCK-8試劑盒，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器CO2培養(yǎng)箱(ESCO公司)；超凈工作臺(tái)、高溫滅菌鍋(Biobase公司)；酶標(biāo)儀(基因有限公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；Western電泳儀(Bio-Rad公司)；水平搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；低溫高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)U87細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。將U87細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上，使用0.25%胰酶消化后傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 藥物配制及分組稱取HLF 100 mg，溶于1 mL DMSO溶液中，配成濃度為100 g·L-1的母液備用，采用DMEM培養(yǎng)基將藥物母液稀釋成相應(yīng)濃度。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將已消化的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)·L-1，然后將細(xì)胞懸液加入相對(duì)應(yīng)的96孔板內(nèi)，每孔100 μL細(xì)胞懸液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將96孔板在培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，棄去原培養(yǎng)基，加入含有相對(duì)應(yīng)藥物濃度的培養(yǎng)基100 μL于96孔板內(nèi)，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)2 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力將U87細(xì)胞消化后均勻鋪在6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)至95%左右時(shí)，用黃槍頭沿每孔的頂端和底部畫一條直線，將原培養(yǎng)基更換為含不同HLF濃度的培養(yǎng)基，并放置培養(yǎng)箱內(nèi)8 h。之后棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定7 min，PBS洗3次，洗去除殘留固定液，使用光學(xué)顯微鏡拍照。細(xì)胞遷移率=(初始細(xì)胞間隙-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞間隙)/(初始細(xì)胞間隙-對(duì)照組細(xì)胞間隙)×100%，設(shè)定對(duì)照組遷移率為1。

1.7 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力細(xì)胞饑餓24 h，將Matrigel膠與培養(yǎng)基按照1∶2的比例混合，每個(gè)小室加入30 μL，鋪平且無(wú)氣泡，放置培養(yǎng)箱內(nèi)40 min，使其凝固。使用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整U87細(xì)胞密度為6×108個(gè)·L-1，并取100 μL加入上室，繼續(xù)加入100 μL含不同濃度HLF的無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入600 μL相應(yīng)濃度HLF的含血清培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出，使用PBS清洗后，加入4%多聚甲醛使其固定10 min，使用棉簽擦去未穿過(guò)小室的細(xì)胞，加入0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，使用PBS洗去多余培養(yǎng)基，待干燥后拍照。細(xì)胞侵襲率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)×100%，設(shè)定對(duì)照組侵襲率為1。

1.8 黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附能力使用培養(yǎng)基按2∶1稀釋Matrigel，并以40 μL每孔加入96孔板內(nèi)，放置培養(yǎng)箱內(nèi)1 h，吸取未凝固的基質(zhì)膠。將不同濃度的HLF預(yù)處理24 h的U87細(xì)胞消化，并調(diào)整密度為108個(gè)·L-1，以100 μL每孔加至96孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱90 min。棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定7 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗3次洗去殘留結(jié)晶紫，使用光學(xué)顯微鏡拍照。每組拍照結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞黏附率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)×100%，設(shè)定對(duì)照組黏附率為1。

1.9 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1.8×107個(gè)·L-1，將U87細(xì)胞按100 μL每孔加至6孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜。將原培養(yǎng)基更換為含不同濃度HLF的培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱內(nèi)7 d。棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定7 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗3次去除殘留結(jié)晶紫，使用光學(xué)顯微鏡拍照。

2 結(jié)果

2.1 HLF對(duì)U87細(xì)胞的增殖抑制作用Fig 1結(jié)果顯示，U87細(xì)胞在不同濃度的HLF作用24 h后，細(xì)胞增殖能力明顯下降，與對(duì)照組相比，HLF(25、50、100 mg·L-1)組的細(xì)胞存活率分別為75.3%、63.9%(P<0.01)、50.5%(P<0.01)，并隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活力明顯降低。

Fig 1 Effects of different concentrations of HLF on proliferation of U87 cells vs control(0 mg·L-1)

2.2 HLF對(duì)U87細(xì)胞遷移能力的影響Fig 2的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HLF處理8 h后，U87細(xì)胞的遷移能力明顯減弱，與對(duì)照組相比，HLF(25、50、100 mg·L-1)組的遷移細(xì)胞比率分別為73.3%、62.0%、52.7%(P<0.05，P<0.01)。提示HLF能明顯降低U87細(xì)胞的遷移能力，且HLF對(duì)其遷移能力的抑制具有一定的濃度依賴性。

Fig 2 Effect of HLF on migration ability of U87 cells vs control(0 mg·L-1)

2.3 HLF對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力的影響Fig 3結(jié)果顯示，HLF處理24 h后，U87細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，與對(duì)照組相比，HLF(25、50 mg·L-1)組的侵襲細(xì)胞比率分別為72.4%、48.9%(P<0.01)。提示HLF能明顯降低U87細(xì)胞的侵襲能力。

Fig 3 Effect of HLF on invasion ability of U87

2.4 HLF對(duì)U87細(xì)胞黏附能力的影響Fig 4結(jié)果顯示，HLF處理24 h后，U87細(xì)胞黏附能力明顯減弱，與對(duì)照組相比，HLF(25、50、100 mg·L-1)組均明顯抑制了U87細(xì)胞與基質(zhì)黏附的能力，抑制率分別為19.5%、40.9%、63.6%(P<0.05，P<0.01)。

2.5 HLF對(duì)U87細(xì)胞克隆形成的影響Fig 5的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HLF處理7 d后，細(xì)胞克隆能力明顯減弱，與對(duì)照組比較,隨著HLF濃度的升高，U87細(xì)胞的克隆形成率逐漸降低，呈濃度依賴性。

3 討論

山楂葉在我國(guó)資源豐富，具有易得、低毒性的特點(diǎn)。HLF是山楂葉提取物中一系列黃酮類化合物的總稱，如蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、葡荊牡黃酮等[8-9]，其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血脂、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗心肌缺血缺氧、抗血管性癡呆、抗細(xì)胞凋亡、抗腫瘤等藥理作用[10]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞是人類最常見、最具侵襲性的腦腫瘤，如何有效抑制惡性腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)、黏附、侵襲及遷移已成為目前研究的熱點(diǎn)，HLF抑制腫瘤細(xì)胞的研究，將為中藥抗腫瘤研究及進(jìn)一步開發(fā)提供新的思路。

Fig 4 Effect of HLF on adhesion ability of U87

本研究CCK-8法檢測(cè)HLF作用后U87細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示，HLF(25、50、100 mg·L-1)組細(xì)胞存活率均降低，當(dāng)HLF濃度>50 mg·L-1時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且這種作用隨著其濃度的增加而增強(qiáng)。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞大而飽滿，輪廓清楚，細(xì)胞間接觸緊密。藥物作用U87細(xì)胞24 h時(shí)，隨著HLF濃度增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞的體積變小，細(xì)胞間距變大，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、脫落，貼壁細(xì)胞輪廓模糊。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，HLF可以抑制U87細(xì)胞的增殖。遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)之一，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HLF作用U87細(xì)胞后，隨著HLF濃度的增加，與對(duì)照組相比，U87細(xì)胞遷移比率明顯下降，提示HLF可以抑制U87細(xì)胞的遷移能力，具有一定的濃度依賴性。腫瘤細(xì)胞與母體瘤分離，穿越血管壁，侵襲周邊正常組織時(shí)，需要一定的侵襲能力，高侵襲的腫瘤細(xì)胞通常具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性。Transwell體外侵襲遷移模型模擬在體外U87細(xì)胞的侵襲狀況，結(jié)果顯示，隨著HLF濃度的增加，與對(duì)照組相比，U87細(xì)胞侵襲數(shù)目均明顯下降，提示HLF能夠有效抑制U87細(xì)胞的侵襲。細(xì)胞的黏附性在維持細(xì)胞外形、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、運(yùn)動(dòng)等功能中起十分重要的作用，黏附是腫瘤細(xì)胞侵襲的始動(dòng)步驟。黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HLF作用U87細(xì)胞24 h后，隨著HLF濃度的增加，與對(duì)照組相比，U87細(xì)胞黏附能力明顯減弱，提示HLF可以抑制U87細(xì)胞與基質(zhì)黏附的能力。

綜上所述，HLF對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、遷移、侵襲及黏附能力有一定的抑制作用，但其作用機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)已公認(rèn)，可以通過(guò)ERK和Akt信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等功能[11-12]，但HLF是否通過(guò)該信號(hào)通路對(duì)U87細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，還有待我們進(jìn)一步探討和研究。

Fig 5 Effect of HLF on cell clonality of U87 cells