七氟醚后處理對失血性休克復(fù)蘇大鼠海馬氧化應(yīng)激及SIRT1/PGC-1α表達的影響

王妍妍，張 麗，黃春霞，朱守峰，楊青青，胡憲文

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，安徽 合肥 230601)

失血性休克是臨床常見的危重癥之一，再灌注策略是治療失血性休克的基本方法，但液體復(fù)蘇的同時可能會加重缺血組織的功能障礙，誘發(fā)缺血/再灌注損傷。腦組織，尤其是海馬組織，對缺血缺氧更加敏感，也更易發(fā)生缺血/再灌注損傷，而氧化應(yīng)激是腦缺血/再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展過程中重要的一環(huán)[1]。

七氟醚是一種揮發(fā)性吸入全身麻醉藥物，我們前期的研究表明，七氟醚后處理可通過減輕海馬CA1區(qū)膽堿能神經(jīng)元損傷，從而改善缺血/再灌注大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力[2]。然而，七氟醚后處理對失血性休克復(fù)蘇大鼠海馬氧化應(yīng)激的影響尚未可知。有研究表明，上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (silent information regulation 1，SIRT1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)蛋白的表達，可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體功能障礙[3]。本實驗擬研究七氟醚后處理對失血性休克復(fù)蘇大鼠海馬氧化應(yīng)激及抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白SIRT1和PGC-1α表達的影響，以探討七氟醚后處理發(fā)揮腦保護作用的初步分子機制，為臨床預(yù)防和治療腦缺血/再灌注損傷提供新的思路和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康成年♂ SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量(300～350) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號:SCXK(皖)2005-001。自由進食飲水,保持動物房內(nèi)溫度(20～25) ℃，濕度50%～55%,黑暗和光照各12 h。

1.1.2試劑 七氟醚(貨號：83291)，購自艾伯維公司；線粒體提取試劑盒(貨號：GMS10006.2)，購自美國GENMED公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒(貨號：A001-3)，購自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒(貨號：S0131)、RIPA裂解液(貨號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：P0012)，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin單克隆抗體(貨號：66009-I-Ig)、PGC-1α單克隆抗體(貨號：66369-I-Ig)，均購自Proteintech公司；SIRT1單克隆抗體(貨號：9475S)，購自美國Cell Signaling Technology公司；ECL顯影液(貨號：34095)，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3儀器 雙向全自動輸液泵(美國Genie Touch公司)；生物機能系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；氣體監(jiān)測儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；七氟醚揮發(fā)罐(Grager公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組 將大鼠按隨機數(shù)據(jù)表法分為3組(每組12只)：假手術(shù)組(Sham 組)、失血性休克復(fù)蘇組(Shock組)、七氟醚后處理組(Sevo 組)。

1.2.2大鼠失血性休克復(fù)蘇模型的制備 模型制備前，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)前禁食8～12 h，可自由飲水。稱重后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉，仰臥位固定于實驗臺，經(jīng)口氣管內(nèi)插管，保持自主呼吸。消毒后，取頸正中切口，分離出右頸總動脈和左頸靜脈后，分別向近心端置入PE50管，連接三通后連接生物機能系統(tǒng)，監(jiān)測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)。通過頸靜脈輸注肝素500 U·kg-1，觀察10 min后，利用雙向全自動輸液泵經(jīng)右頸總動脈持續(xù)勻速抽血30 min，抽出的血液存儲于無菌10 mL注射器中，抽血量為大鼠總血容量的40%。抽血結(jié)束后1 h，于30 min內(nèi)經(jīng)左頸靜脈回輸全部抽血量，建立失血性休克復(fù)蘇模型。Sham組動靜脈置管等手術(shù)操作同Shock組，但不放血。

1.2.3七氟醚后處理 參照文獻[4]介紹的方法實施七氟醚后處理。將即將接受血液回輸?shù)拇笫笾糜谧灾瓢朊荛]有機玻璃容器(30 cm×20 cm×20 cm)內(nèi)，容器相對的兩面各留一直徑約2 cm的圓孔,分別作為進氣孔和出氣孔。出氣孔接呼氣末麻醉藥濃度監(jiān)測儀，持續(xù)監(jiān)測七氟醚、O2及CO2的濃度。容器底部鋪上適量鈉石灰，利用(95% O2，5% CO2)混合氣體帶動七氟醚通過進氣孔進入有機玻璃容器內(nèi)，調(diào)節(jié)七氟醚揮發(fā)罐，使七氟醚呼氣末濃度達到2.4%，并維持30 min。Sham組和Shock組在相應(yīng)時間點被放入容器內(nèi)，吸入95% O2，5% CO2混合氣30 min。

1.2.4MAP的監(jiān)測 監(jiān)測并記錄放血即刻(T0)、放血結(jié)束即刻(T1)、血液回輸即刻(T2)和血液回輸結(jié)束即刻(T3)三組的MAP。

1.2.5血氣分析 在上述T0、T1、T2、T3時間點，取0.2 mL動脈血進行血氣分析，記錄血pH值、堿剩余(base excess,BE)和乳酸(Lac)濃度。從動脈抽取0.2 mL血的同時，經(jīng)靜脈輸注0.2 mL生理鹽水，以作補充。

1.2.6海馬線粒體的提取 自體血回輸24 h后，各組隨機選取6只大鼠，按50 mg·kg-1劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉，迅速斷頭取腦，分離出海馬組織。稱重后剪碎，加入按照線粒體分離試劑盒說明書配制的海馬線粒體裂解液，研磨后，將混合物置于1.5 mL EP管中，4 ℃、1 500×g離心10 min后取上清，10 000×g離心10 min,棄上清，所得沉淀即為線粒體，加入儲存液，重懸混勻后，置于4 ℃冰上待用。

1.2.7海馬線粒體SOD活性檢測 取上述提取的海馬線粒體，利用BCA試劑盒測定線粒體蛋白濃度后，根據(jù)SOD測定試劑盒說明書，依次加樣對照孔、對照空白孔、測定孔、測定空白孔，37 ℃孵育20 min,測定各孔在450 nm處的吸光度，再根據(jù)相應(yīng)公式計算出相應(yīng)線粒體樣品的SOD活性。

1.2.8海馬組織MDA含量測定 自體血回輸結(jié)束24 h后,取各組剩余的6只大鼠的海馬組織，保存于-80 ℃冰箱備用。將適量海馬組織剪碎后，置于玻璃勻漿器中，加入RIPA裂解液，研磨充分后冰浴30 min;混合物4 ℃、13 200 r·min-1離心30 min后，取上清。留部分上清做BCA蛋白定量，剩下部分上清液依據(jù)MDA檢測試劑盒說明書，基于MDA和硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，通過比色法，用酶標(biāo)儀分別測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和各樣品在532 nm的吸光度，計算各樣品中的MDA含量。

1.2.9Western blot法檢測SIRT1和PGC-1α蛋白的表達 取上述提取的剩余各組海馬組織蛋白，加入上樣緩沖液，100 ℃變性10 min,保存于-20 ℃。取蛋白進行8% SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗滌后，分別加入β-actin一抗(稀釋度1∶10 000)、SIRT1一抗(稀釋度1∶1 000)、PGC-1α一抗(稀釋度1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日TBST洗滌，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后，在暗室進行ECL顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過Image J軟件測定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，反映目的蛋白的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間點MAP的變化如Tab 1所示，T0時和T3時3組大鼠MAP比較無明顯差異(P>0.05)；與Sham組比較，Shock組和Sevo組在T1和T2時MAP降低(P<0.05)。

Tab 1 MAP during hemorrhagic shock and resuscitation

2.2 各組動脈血氣分析結(jié)果如Tab 2所示，T0時和T3時3組大鼠pH值、BE和Lac值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Sham組比較，Shock組和Sevo組在T1和T2時pH值降低，BE值降低，Lac升高(P<0.05)，且兩組間無明顯差異(P>0.05)。

2.3 七氟醚后處理對失血性休克復(fù)蘇大鼠海馬線粒體SOD活性的影響SOD活性檢測結(jié)果顯示(Fig 1)，與Sham組相比，Shock組海馬線粒體SOD活性明顯降低(P<0.05)；與Shock組相比，Sevo組SOD活性增加(P<0.05)。

Fig 1 Effects of sevoflurane postconditioning on activity of SOD in mitochondria isolated from hippocampus

2.4 七氟醚后處理對海馬MDA含量影響MDA檢測結(jié)果顯示(Fig 2)，與Sham組相比，Shock組MDA含量明顯增加(P<0.05)；與Shock組相比，Sevo組MDA含量降低(P<0.05)。

2.5 七氟醚后處理對失血性休克復(fù)蘇大鼠海馬SIRT1和PGC-1α蛋白表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 3)，與Sham組相比，Shock組SIRT1和PGC-1α表達增加(P<0.05)；與Shock組相比，Sevo組SIRT1和PGC-1α表達增加(P<0.05)。

3 討論

七氟醚是近年來臨床常用的吸入麻醉劑，基礎(chǔ)和臨床研究證實，七氟醚預(yù)處理和后處理均能發(fā)揮腦保護作用。在Dang等[5]的研究中，七氟醚預(yù)處理可以影響腦缺血/再灌注后早期小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的遷移、吞噬和增殖，從而改善腦神經(jīng)功能。也有實驗表明，七氟醚后處理可以抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，縮短缺血/再灌注大鼠在水迷宮實驗中的逃避潛伏期，下調(diào)促凋亡蛋白Bax,上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提示七氟醚后處理可以通過減輕線粒體功能障礙，減輕腦缺血/再灌注損傷[6]。

Fig 2 Effects of sevoflurane postconditioning on content of MDA in hippocampus

Fig 3 Effects of sevoflurane postconditioning on expression of SIRT1 and PGC-1α

本實驗采用經(jīng)右頸總動脈放血30 min，缺血1 h后，在30 min內(nèi)回輸全部自體血的方法，制備大鼠失血性休克復(fù)蘇模型，模擬全身性缺血/再灌注過程。結(jié)果表明，與Sham組比較，Shock組和Sevo組放血后MAP明顯降低，pH值和BE降低，Lac升高，提示大鼠失血性休克模型制備成功?；剌斪泽w血后，MAP升高，pH值、BE和Lac與放血前無明顯差異，且大鼠均存活，提示復(fù)蘇成功。

Tab 2 Arterial blood gases results

腦缺血/再灌注損傷是一個多因素參與的病理生理過程，包括炎癥反應(yīng)、細胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性氨基酸毒性作用，以及與ATP生成減少、活性氧(ROS)蓄積、線粒體功能障礙等有關(guān)的氧化應(yīng)激[7-8]。MDA是機體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的產(chǎn)物之一,對細胞的代謝和功能均有明顯的影響，其含量的高低也能體現(xiàn)機體受ROS攻擊和損傷的程度[9]。本實驗中，Shock組大鼠海馬組織MDA含量明顯增加，其原因可能是失血性休克復(fù)蘇增加了大鼠腦內(nèi)ROS的產(chǎn)生，蓄積的ROS引發(fā)了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。而七氟醚后處理減少了MDA的產(chǎn)生，改善了腦組織氧化應(yīng)激損傷。SOD是機體關(guān)鍵的抗氧化超氧歧化物酶類,其水平可以間接反映機體抗氧化應(yīng)激能力[10]。檢測失血性休克與復(fù)蘇大鼠海馬線粒體SOD活性發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，其活性明顯降低，而七氟醚后處理可以增加線粒體SOD活性，表明七氟醚后處理可能通過線粒體相關(guān)信號途徑，提高機體抗氧化應(yīng)激能力。

為了進一步探討七氟醚后處理減輕失血性休克復(fù)蘇大鼠氧化應(yīng)激可能的分子機制，本實驗采用Western blot法檢測海馬組織中SIRT1和PGC-1α蛋白的表達。SIRT1是NAD+依賴的組蛋白去乙?；?，在抵抗氧化應(yīng)激、抑制細胞凋亡及神經(jīng)細胞保護等方面發(fā)揮調(diào)控作用[11]。PGC-1α是SIRT1的作用底物之一，參與線粒體生物合成及功能維持，是在抗氧應(yīng)激作用中有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，SIRT1表達增加可以激活PGC-1α的轉(zhuǎn)錄，從而增加線粒體密度，進而通過誘導(dǎo)抗氧化酶的表達、清除活性氧、抗線粒體損傷等，提高機體抗氧化應(yīng)激能力[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與Shock組相比，Sevo組SIRT1和PGC-1α蛋白表達增加，表明七氟醚后處理可以促進SIRT1和PGC-1α蛋白的表達，增強機體抗氧化應(yīng)激能力。而Shock組的SIRT1和PGC-1α表達量高于Sham組，可能是失血性休克復(fù)蘇刺激了內(nèi)源性SIRT1和PGC-1α的表達，以抵抗缺血/再灌注損傷過程中的氧化應(yīng)激等損傷。

綜上所述，七氟醚后處理可以通過上調(diào)SIRT1、PGC-1α蛋白的表達，減輕失血性休克復(fù)蘇大鼠海馬的氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究證實[14]，PGC-1α可與下游的核呼吸因子1結(jié)合，再激活線粒體轉(zhuǎn)錄因子A，產(chǎn)生更多的生物學(xué)效應(yīng)。本課題組也將深入研究SIRT1/PGC-1α及下游分子在七氟醚后處理減輕腦缺血/再灌注損傷中的作用。