去甲腎上腺素在抑郁狀態(tài)下提高乳腺癌的惡性程度

歐陽雪巖，朱 朕，楊 超，王 麗，丁 罡,4，姜 峰

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院癌痛轉(zhuǎn)化研究所，上海 202150；4. 上海國際醫(yī)學(xué)中心，上海 201318)

乳腺癌在女性中發(fā)病率最高，且乳腺癌患者更易罹患心理疾病[1]。抑郁癥作為世界第四大常見疾病，被認(rèn)為是影響乳腺癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。有臨床研究顯示，存在抑郁癥狀的癌癥患者預(yù)后較差[3]。因此，本研究從臨床現(xiàn)象出發(fā)，利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，探究抑郁對乳腺癌惡性程度的影響，以期加強(qiáng)臨床治療過程中對腫瘤患者情緒管理的重視程度。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1一般資料 選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院2018年1月～2018年12月收治的乳腺癌患者116例，女性，年齡40～65歲。所有病例均由病理學(xué)及臨床診斷確診。

1.1.2研究方法 采用問卷調(diào)查法對腫瘤患者心理狀況進(jìn)行評價(jià)分析，并與國內(nèi)常模進(jìn)行比較[4]，評定時(shí)間為腫瘤患者近1周的心理狀況。在患者簽署知情同意書后方可進(jìn)行。

1.1.3評價(jià)工具 對入選的腫瘤患者采用Zung編制的抑郁自評量表(SDS)進(jìn)行評測[4]，SDS量表采用1～4級評分，共20個(gè)項(xiàng)目，總分80分。標(biāo)準(zhǔn)分等于總評分乘以1.25。SDS標(biāo)準(zhǔn)分<53為無抑郁組，53～62分為輕度抑郁組，63～72分為中度抑郁組，>73分為重度抑郁組。

1.1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。評定結(jié)果以%表示。與國內(nèi)常模進(jìn)行比較分析，采用獨(dú)立結(jié)果t檢驗(yàn)。

1.2 慢性輕度不可預(yù)測性應(yīng)激模型(chronic unpredictable mild stress model, CUMS)

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物 該部分實(shí)驗(yàn)所有小鼠分為兩組，每組包含10只♀ C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購自上海捷斯杰實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2018-0004，用于CUMS模型的構(gòu)建。動物實(shí)驗(yàn)按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物護(hù)理與使用委員會批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.2.2造模方案 造模方案參考Jaggi等[5]已發(fā)表文獻(xiàn)，并在此基礎(chǔ)上稍作調(diào)整。將小鼠置于明暗12 h∶12 h的循環(huán)中(早上7點(diǎn)開燈)，室溫25 ℃，小鼠可自由地獲得水和食物。將小鼠隨機(jī)分為對照組或?qū)嶒?yàn)組(n=10)。實(shí)驗(yàn)組暴露于不可預(yù)見的應(yīng)激源下，對照組則不經(jīng)歷應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)激刺激具體過程見Tab 1。在這些應(yīng)激刺激之后，使用行為學(xué)檢測(曠場實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和蔗糖偏好實(shí)驗(yàn))來確認(rèn)動物是否具有明顯的抑郁癥狀。

1.2.3小鼠皮下荷瘤模型 參考謝貴林等[6]利用C57BL/6小鼠皮下接種乳腺癌細(xì)胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型的方法及經(jīng)驗(yàn)，在造模成功后，對所有動物進(jìn)行皮下接種乳腺癌細(xì)胞。接種乳腺癌細(xì)胞之前，首先將小鼠置于X射線下照射4 h，注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺35 mg·kg-1，降低其免疫功能。小鼠皮下注射懸浮在0.2 mL PBS中的MCF-7細(xì)胞(1×107)。兩周后處死小鼠，剝離腫瘤，計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積=(a×b2)/2，其中a為最大表面直徑，b為最小表面直徑，并收集所有動物的血清。

Tab 1 CUMS model procedure

1.3 ELISA法檢測去甲腎上腺素水平在模型建立結(jié)束時(shí)，收集來自對照組和實(shí)驗(yàn)組動物的血液。將收集的樣品在室溫下靜置40 min，然后3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。吸出300 μL血清，加入等體積的HCl后，1 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。使用ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)檢測血清中的去甲腎上腺素。每個(gè)樣品測定3次，并且基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品的平均OD值。該實(shí)驗(yàn)過程獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，購自上海生命科學(xué)研究院和中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加1%雙抗和10%熱滅活的胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)，在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.5 免疫熒光染色將MCF-7細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞的密度加入6孔板中，蓋上蓋玻片24 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用0.15% Triton透化，然后PBS再次充分洗滌。將細(xì)胞與腎上腺素β1受體(β1-adrenergic receptor，β1-AR)、腎上腺素β2受體(β2-adrenergic receptor，β2-AR)(美國Abcam公司)或基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2，MMP-2) (碧云天生物科技)的一抗(1∶100)在室溫下孵育1 h。然后，將細(xì)胞與二抗(1∶1 000)在室溫條件下避光孵育1 h。再次用PBS洗滌，用DAPI(生工生物工程股份有限公司)對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染，并用熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察。

1.6 細(xì)胞增殖測定使用CCK-8(Life Technologies)評估細(xì)胞活力。將細(xì)胞接種于96孔板(每孔1×103個(gè)，100 μL)中，將去甲腎上腺素(0、0.1、1、10、100 μmol·L-1)加入孔中，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24、48、72 h。向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8，溫育2 h后，使用Multiskan FC酶免疫測定分析儀(Thermo Fisher Scientific)檢測450 nm處的吸光度(OD)。使用對照孔中未處理細(xì)胞的吸光度讀數(shù)進(jìn)行對比，以獲得細(xì)胞存活百分比。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)使用劃痕實(shí)驗(yàn)確定細(xì)胞遷移能力。將MCF-7細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中，并在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，將細(xì)胞分為加入10 μmol·L-1去甲腎上腺素(Sigma公司)組；20 μmol·L-1普萘洛爾(Sigma公司)處理組以及對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔用PBS洗滌3次。在顯微鏡下選取視野觀察。

1.8 細(xì)胞侵襲測定將MCF-7細(xì)胞(3×103個(gè))置于上部Transwell小室(24孔板，0.8 μm孔徑，Corning Costar公司)上，小室內(nèi)底面涂抹覆蓋Matrigel(Sigma公司)，并加入200 μL無血清的培養(yǎng)液。下室加入500 μL含有10%胎牛血清的DMEM，分為普萘洛爾預(yù)處理并加去甲腎上腺素組、10 μmol·L-1去甲腎上腺素組、普萘洛爾組、對照組。在37 ℃溫育24 h后，用棉簽輕擦上層小室內(nèi)底面的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下膜表面的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)(Leica公司)。 獨(dú)立進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)并比較結(jié)果。

1.9 細(xì)胞周期測定將MCF-7細(xì)胞按處理方法分為4組：去甲腎上腺素(10 μmol·L-1)、去甲腎上腺素與普萘洛爾同時(shí)處理、或普萘洛爾單獨(dú)處理或不經(jīng)過處理。然后使用胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，4 ℃下在冷凍的70%乙醇中固定過夜。收集固定的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，懸浮于含有10 mg·L-1碘化丙啶(PI，美國Sigma公司)和100 mg·L-1RNase A的PBS中， 4 ℃避光孵育至少30 min。使用流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson FACScan)測定細(xì)胞周期分布。

1.10 蛋白提取和蛋白質(zhì)印跡用含有蛋白酶抑制劑PMSF的200 μL RIPA裂解液裂解MCF-7細(xì)胞，收集總蛋白。使用BCA蛋白質(zhì)測定法測定提取的蛋白質(zhì)濃度。蛋白上樣量30 μg，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h，然后用Trident ECL(碧云天生物科技)顯色。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者的抑郁評估結(jié)果對116例乳腺癌患者抑郁的發(fā)生率評估結(jié)果顯示(Fig 1)，48%乳腺癌患者伴有抑郁癥狀(56/116)，超過國內(nèi)常模的抑郁發(fā)生率。其中輕度抑郁24人，中度抑郁21人，重度抑郁11人。從評分來看，乳腺癌患者SDS的評分為(65.0±3.2)，高于國內(nèi)常模的評分(42±11)。

Fig 1 High incidence of depressive symptoms in breast cancer patients

2.2 小鼠血清中的去甲腎上腺素濃度與抑郁程度存在正相關(guān)為了確定應(yīng)激模型組與對照組血清之間去甲腎上腺素的差異，對收集的血清樣本進(jìn)行了ELISA檢測。Fig 2結(jié)果表明，CUMS模型組小鼠血清中的去甲腎上腺素水平較對照組明顯升高。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，造模組小鼠的去甲腎上腺素水平與抑郁程度呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示，抑郁可以促進(jìn)動物血清去甲腎上腺素水平的提高。

2.3 抑郁癥狀可以促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展如Fig 3所示，在經(jīng)過不可預(yù)見性應(yīng)激刺激以后，CUMS模型組小鼠的腫瘤體積(2 797±126)mm3,與對照組小鼠腫瘤體積(1 943±224)mm3差異有顯著性。表明抑郁作為一個(gè)獨(dú)立因素，可以促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展。

2.4 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中存在β-ARs的表達(dá)為了研究去甲腎上腺素是否直接影響乳腺癌的發(fā)展，檢測了MCF-7細(xì)胞中是否存在β-ARs的表達(dá)。Fig 4A的Western blot結(jié)果顯示，β1-AR和β2-AR均在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)。另外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)支持這一結(jié)果(Fig 4B)。

Fig 2 Serum norepinephrine levels in CUMS model and its relationship with depression severity n=10)

Fig 3 Development of breast cancer promoted by depressive symptoms n=10)

Fig 4 Expression of β-adrenalin receptors in human breast cancer cells n=3)

2.5 去甲腎上腺素可以增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞的惡性程度，這種增強(qiáng)作用可以被β受體阻滯劑普萘洛爾減弱首先，CCK-8檢測結(jié)果表明，去甲腎上腺素可劑量依賴性地促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖(Fig 5)。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測了MCF-7乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，且免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)去甲腎上腺素處理后，MMP-2的水平升高，表明去甲腎上腺素可以使腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，而這種增強(qiáng)作用可被普萘洛爾抑制(Fig 6)。在劃痕實(shí)驗(yàn)中(Fig 7)，觀察到去甲腎上腺素對細(xì)胞的遷移發(fā)揮促進(jìn)作用，并且這種促進(jìn)作用可被普萘洛爾明顯消除。以上結(jié)果表明，去甲腎上腺素可以增加乳腺癌的惡性程度。

Fig 5 Proliferation of MCF-7 cells promoted by norepinephrine n=3)

2.6 去甲腎上腺素促進(jìn)細(xì)胞周期從G期向S期轉(zhuǎn)變?yōu)榱舜_定去甲腎上腺素對細(xì)胞周期的影響，使用流式細(xì)胞儀確定去甲腎上腺素是否會影響DNA合成。如Fig 8所示，去甲腎上腺素可以導(dǎo)致S期細(xì)胞積累的增加，G期細(xì)胞的積累減少，而用普萘洛爾預(yù)處理后，促進(jìn)細(xì)胞從G期轉(zhuǎn)變?yōu)镾期的作用降低。由于DNA的合成發(fā)生在S期，因此，可以認(rèn)為去甲腎上腺素可以促進(jìn)DNA合成,但這種促進(jìn)作用差異無顯著性。

2.7 去甲腎上腺素通過p38 MAPK通路刺激MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲為了探明去甲腎上腺素通過何種途徑促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，使用Western blot檢測了p38 MAPK通路的激活。Fig 9結(jié)果表明，去甲腎上腺素處理后，p-p38 MAPK表達(dá)量增加，且普萘洛爾可以削弱這一作用，各組p38 MAPK表達(dá)則沒有差異。因此推測，β-AR的激活可能會提高p38 MAPK信號通路的磷酸化程度。

Fig 6 Invasive ability of MCF-7 cells increased by norepinephrine

3 討論

有研究證實(shí)，30%～70%的腫瘤患者伴有不同程度的抑郁癥狀[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中抑郁癥狀的發(fā)生率高于國內(nèi)常模。為了更好地揭示抑郁對腫瘤是否存在促進(jìn)作用，我們采用了CUMS模型來模擬臨床慢性抑郁，對小鼠皮下荷瘤后的一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，抑郁一定程度上促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程。Chang等[8]的研究與本研究涉及的實(shí)驗(yàn)相似，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，動物血清中抑郁相關(guān)激素，即去甲腎上腺素含量明顯上升。針對這一結(jié)果，我們在細(xì)胞層面上進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，證實(shí)去甲腎上腺素可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤[9]、卵巢癌[10]以及前列腺癌[11]中的相關(guān)類似結(jié)果。

Fig 7 Migration ability of MCF-7 cells increased by norepinephrine

信號通路方面的相關(guān)研究指出，Akt[12]、mTOR[13]可能作為抑郁影響腫瘤的信號通路。本研究證實(shí)，p38 MAPK信號通路的特殊性[14-15]，因此可能在抑郁促進(jìn)乳腺癌進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。因此，血清去甲腎上腺素可以作為判斷乳腺癌患者抑郁程度的一項(xiàng)指標(biāo)，提示及時(shí)關(guān)注患者心理狀態(tài)，采取積極的處理措施，降低抑郁情緒對乳腺癌的不良影響。然而，在本研究臨床部分的研究中，考慮到腫瘤患者疾病進(jìn)程的特殊性，填寫問卷易加重患者的心理負(fù)擔(dān)，與我們研究主旨相悖，因此本研究臨床樣本量不夠大，未來的研究會立足患者角度，適當(dāng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行補(bǔ)充研究。

綜上所述，心理問題持續(xù)存在于乳腺癌的發(fā)病、診斷和治療過程中，不同程度地影響著患者的預(yù)后?，F(xiàn)有抗腫瘤治療的理念不斷進(jìn)步及醫(yī)療技術(shù)的持續(xù)更新，可能均無法減少患者經(jīng)歷心理問題帶來的持續(xù)折磨。心理問題是與治療過程中的技術(shù)性問題無關(guān)的獨(dú)立存在。我們提倡對于存在抑郁癥狀的乳腺癌患者進(jìn)行及時(shí)的、有針對性的心理干預(yù)，本質(zhì)上是對于乳腺癌完整治療策略的一種補(bǔ)充。重視乳腺癌患者抑郁癥狀的臨床表現(xiàn)，提高乳腺癌患者抗腫瘤治療的有效性，無疑將為乳腺癌治療提供新的思路，這在臨床抗腫瘤治療過程中具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

Fig 8 Results of cell circle experiments n=3) *P<0.05 vs control group

Fig 9 Expression of p-p38 in MCF-7 cells promoted by norepinephrine

(致謝：本實(shí)驗(yàn)完成于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院新華癌痛轉(zhuǎn)化研究所，在此特別感謝于瑞華、倪祖琴、姚愛玉、程志軍等實(shí)驗(yàn)室同仁的大力幫助。)