梔子苷抑制高糖誘導(dǎo)的乳鼠心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化

向家培，雷玉華

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，恩施 445000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是獨(dú)立于糖尿病的并發(fā)癥之一，同時(shí)也是晚期造成糖尿病患者死亡的主要原因。心肌間質(zhì)纖維化是DCM的主要病理表現(xiàn)之一[1]。心肌纖維化能增加心室壁僵硬度，降低心室順應(yīng)性，導(dǎo)致心臟舒縮功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭[2]。心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CF)是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成和降解的主要細(xì)胞，在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。研究表明，高糖刺激一方面能夠促進(jìn)CF增殖，加速膠原合成；另一方面，能夠直接激活轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)/Smads信號(hào)通路，促進(jìn)CF細(xì)胞中Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、Col Ⅲ及結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)的合成，最終增加心肌組織ECM的合成[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator，SIRT)1是哺乳動(dòng)物體內(nèi)與酵母SIRT2同源性最高的同系物，與機(jī)體氧化應(yīng)激、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞衰老等多種生命活動(dòng)密切相關(guān)[5]。在DCM中，SIRT1能夠通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用[6]。此外，SIRT1還能夠通過抑制乙?；腟mad3(acetylated-Smad3，ac-Smad3)信號(hào)通路減輕腎臟纖維化[7]。

梔子苷(geniposide，GE)，又名京尼平苷，屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物[8]。目前，GE已被證實(shí)具有抗炎癥、抗腫瘤、抗凋亡及抗血管生成等多種藥理作用[9]。在心血管疾病中，GE能夠抑制胸主動(dòng)脈縮窄(thoracic aortic constriction，TAC)誘導(dǎo)的心肌肥厚，其機(jī)制與GE對(duì)心肌細(xì)胞中腺苷酸活化蛋白激酶α(adenosine monophosphate activated protein kinase α，AMPKα)的抑制有關(guān)[10]。而GE在DCM中的作用尚未見報(bào)到。本文將主要探討GE對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠CF的轉(zhuǎn)化及膠原合成的作用，以及可能涉及的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

GE購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度大于98%。將GE溶解在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)中配置成不同濃度的GE溶液待使用。出生1～3 d的Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。氧化應(yīng)激檢測試劑盒包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAPDH)，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；低糖DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；甘露醇、葡萄糖、Trizol Reagen購自美國Invitrogen公司；引物由武漢谷歌生物公司合成和純化。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CF的分離和培養(yǎng) 無菌條件下剪取乳鼠心臟前1/3的心室部分，用0.25%胰蛋白酶消化心肌組織，差速貼壁1 h去除未貼壁的心肌細(xì)胞。采用DMEM + 10%胎牛血清 + 雙抗培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)乳鼠CF，選用第2～3代傳代細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化CF。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定GE的最佳保護(hù)濃度為100 μmol/L。實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)正常對(duì)照(normal control，NC)組；(2)NC+GE組；(3)高糖(葡萄糖，濃度為33.3 mmol/L)模型組；(4)高糖 + GE組。每組設(shè)置 5個(gè)復(fù)孔，并接受相應(yīng)處理。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測膠原mRNA的表達(dá) (1)Trizol法提取CF中RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度及純度，A260/A280=1.8～2.0方可使用；(2)通過逆轉(zhuǎn)錄，將mRNA合成為cDNA，并放入-80℃冰箱保存；(3)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)體系包括：10×Buffer 2.5 μl、cDNA 2 μl、正向引物(20 μmol/L)0.25 μl、反向引物(20 μmol/L)0.25 μl、去氧核苷酸(deoxynucleotide polymerases，dNTPs；10 mmol/L)0.5 μl、Taq酶(2×106U/L)0.5 μl和雙蒸水19 μl。引物序列見表1。

表1 RT-PCR中各指標(biāo)引物序列

GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; CTGF: connective tissue growth factor.

1.2.4 Western blot檢測 在直徑為100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種6 ml CF懸液，細(xì)胞密度約107/皿。CF長至70%匯合時(shí)，饑餓處理12 h，使其同步化生長。隨后按照分組給予高糖和GE刺激，24 h后提取細(xì)胞中總蛋白。具體過程如下：(1)首先棄去培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液，PBS洗3次；(2)每皿加入1 000 μl裂解液，充分震蕩20 min；(3)用毛刷將皿底的細(xì)胞充分刮下，放入準(zhǔn)備好的EP管中；(4)將收集的細(xì)胞，用超聲裂解儀裂解15 s左右；(5)靜置15 min后，離心0.5 h(12 000轉(zhuǎn)/min)；(6)取上清分裝至EP管，采用紫外分光光度法測量蛋白濃度后，將所有樣本的蛋白定容至等濃度；(7)分裝后放入-80℃冰箱。CF總蛋白提取后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜中，一抗4℃孵育過夜，隨后于羊抗兔二抗中避光孵育1 h，利用Odyssey掃膜儀對(duì)蛋白條帶掃描并定量，GAPDH校正待測蛋白水平。

1.2.5 免疫熒光染色 (1)4%多聚甲醛固定；(2)0.2%的Triton破膜；(3)8%山羊血清封閉1 h；(4)一抗[包括抗SIRT1抗體和抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體]封閉過夜；(5)羊抗鼠和羊抗兔二抗共同孵育1 h；(6)DAPI染核；(7)熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠CF的鑒定

原代分離及純化后的大鼠CF經(jīng)培養(yǎng)12 h后，基本貼壁。倒置顯微鏡下可見CF呈梭形，多角型。CF細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈放射狀、網(wǎng)狀及漩渦狀分布。CF細(xì)胞核為圓形，胞漿透明(圖1A)。波形蛋白免疫熒光顯示，陽性染色細(xì)胞占比超過全視野所有細(xì)胞的95%(圖1B)。

圖1 大鼠左室心臟成纖維細(xì)胞鑒定

A: light mcroscope (×40); B: immunofluorescent staining of vimentin (×100)

2.2 高糖和GE對(duì)CF纖維化標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，高糖刺激下，大鼠CF的ColⅠ、Ⅲ及CTGF mRNA表達(dá)顯著升高，證明高糖能夠誘導(dǎo)大鼠CF細(xì)胞膠原增多；不同濃度的GE處理高糖刺激后的大鼠CF 24 h后，ColⅠ、Ⅲ及CTGFmRNA表達(dá)有所降低，且隨GE濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，在1～100 μmol/L之間呈現(xiàn)濃度依賴性(均P<0.05；圖2)。

2.3 各組氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平比較

使用氧化應(yīng)激試劑盒對(duì)CF中氧化應(yīng)激標(biāo)志物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與NC組相比，高糖模型組的SOD活性顯著降低，NADPH活性和MDA產(chǎn)量均顯著增高；而GE能夠顯著抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(均P<0.05；圖3)。

2.4 各組心肌纖維化信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測

高糖刺激后，非經(jīng)典的促纖維化信號(hào)通路TGF-β/ac-Smad3和α-SMA蛋白的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；使用GE干預(yù)后，上述促纖維化信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯受到抑制(P<0.05)。同時(shí)，我們檢測了CF中SIRT1蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示，高糖刺激后，SIRT1表達(dá)水平明顯受抑制；而GE干預(yù)后，SIRT1表達(dá)水平顯著上升(均P<0.05；圖4)。

2.5 EX-527對(duì)GE藥理作用的影響

EX-527為SIRT1抑制劑，我們用免疫熒光共染了CF中的SIRT1及α-SMA，結(jié)果表明，CF中SIRT1被GE或EX-527激活后，α-SMA表達(dá)水平明顯下降(圖5A)。同時(shí)利用氧化應(yīng)激試劑盒再次檢測了CF氧化應(yīng)激水平，結(jié)果表明，在加入EX-527后，GE對(duì)高糖刺激下CF表型轉(zhuǎn)化的抑制作用消失；且EX-527也可以使GE對(duì)高糖刺激下氧化應(yīng)激及ac-Smad3信號(hào)通路的抑制作用消失(圖5B-H)。證明了GE對(duì)高糖刺激下CF轉(zhuǎn)化及膠原合成的抑制作用依賴于SIRT1。

3 討 論

心肌纖維化是DCM主要的病理改變，極大地增加了糖尿病患者心力衰竭的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。CF作為心臟中主要的細(xì)胞類型之一，一旦被各組刺激因素(高糖、異丙腎上腺素、TGF-β等)激活便可合成并分泌膠原，導(dǎo)致心肌中ECM的沉積。此外，CF轉(zhuǎn)化為表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞也是合成ECM的一個(gè)重要來源[2]。研究發(fā)現(xiàn)，高糖可通過促進(jìn)心臟間質(zhì)膠原沉積誘發(fā)心肌纖維化。一方面，高糖可以抑制間質(zhì)內(nèi)膠原的降解；另一方面，高糖又可促進(jìn)膠原蛋白的糖基化，增加心臟間質(zhì)中膠原的合成。因此，阻斷CF的表型轉(zhuǎn)化及膠原合成對(duì)干預(yù)DCM具有重要意義[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，GE可以通過抑制SIRT1的表達(dá)進(jìn)而阻斷高糖誘導(dǎo)的CF表型轉(zhuǎn)化及膠原合成。

圖2 不同濃度GE對(duì)高糖刺激下纖維化標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響

圖3 各組氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平比較

圖4 GE對(duì)高糖刺激下CF中TGF-β/ac-Smad3信號(hào)通路及SIRT1蛋白表達(dá)的影響

圖5 EX-527對(duì)GE藥理作用的影響

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，TGF-β/磷酸化的Smad3(phosphorylated-Smad3，P-Smad3)信號(hào)通路是經(jīng)典的促心肌纖維化信號(hào)通路，在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用。此信號(hào)通路激活的基本過程如下：TGF-β與TGF-β受體Ⅱ結(jié)合后，可激活TGF-β受體Ⅰ。隨后，活化的TGF-β受體Ⅰ可磷酸化Smad3。磷酸化的Smad3再與Smad4結(jié)合后入核，直接或間接地激活促纖維化相關(guān)基因[12]。最近研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β刺激能夠激活細(xì)胞內(nèi)乙?；竝300的催化活性，將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到Smad3的賴氨酸氨基殘端，進(jìn)而對(duì)Smad3進(jìn)行乙酰化修飾，調(diào)節(jié)Smad3的DNA連接酶活性或轉(zhuǎn)錄活性[13，14]。因此，抑制Smad3的乙?；彩侵委熜募±w維化的關(guān)鍵策略之一。

在糖尿病狀態(tài)下，心肌膠原代謝氧化失衡，氧化應(yīng)激通過促進(jìn)TGF-β的表達(dá)增加CF向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，從而加強(qiáng)膠原合成、促進(jìn)DCM患者心臟纖維化。因此，抑制CF氧化應(yīng)激是治療DCM的重要靶點(diǎn)之一[1]。Gu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)CF中乙醛脫氫酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)的表達(dá)能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的CF膠原產(chǎn)生，其機(jī)制可能與CF中氧化應(yīng)激的降低有關(guān)。

近年來，組蛋白去乙?；窼IRT1在纖維化疾病中的作用日益受到關(guān)注。據(jù)報(bào)道，SIRT1可通過激活TGF-β/ac-Smad3信號(hào)通路和抑制氧化應(yīng)激，改善腎間質(zhì)纖維化[7]。此外，SIRT1還能夠降低ac-Smad4和β-catenin蛋白的表達(dá)，抑制內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及器官纖維化[16]。體外實(shí)驗(yàn)證明，蝦青素可以通過激活SIRT1進(jìn)而抑制Smad3的乙?；?，最終減輕壓力負(fù)荷過載所致的心肌纖維化和心功能不全[2]。SIRT1在抗氧化應(yīng)激中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，例如SIRT1可以通過將P53的第382位的賴氨酸殘基去乙?；?，抑制P53的生理活性，最終抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激所致的病理損傷[5]。這些研究結(jié)果提示，SIRT1對(duì)纖維化的發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞的氧化應(yīng)激發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在本研究中，我們利用高糖在體外對(duì)乳鼠CF細(xì)胞進(jìn)行刺激，同時(shí)利用GE進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GE能夠明顯降低高糖環(huán)境中CF的氧化應(yīng)激水平及各種膠原的合成，抑制Smad3的乙酰化，同時(shí)GE能夠激活CF細(xì)胞中SIRT1蛋白的表達(dá)。SIRT1一旦被抑制，GE的抑纖維化作用消失，表明GE的抑纖維化作用依賴于CF細(xì)胞中SIRT1的激活。

總之，我們的研究首次證實(shí)GE能夠降低高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及膠原合成，這種保護(hù)作用可能與GE對(duì)CF中氧化應(yīng)激及Smad3乙酰化的抑制有關(guān)，且這種抑制作用依賴于SIRT1的激活。