基因治療中的穿膜肽轉(zhuǎn)染機(jī)制

王鶴

【摘 要】基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療疾病的目的?；?因治療 的策略主要包括：對(duì)有缺 陷的基因進(jìn)行修復(fù)，或者用正常的基 因替換致病基因 ， 糾正人 自身基 因功能和表達(dá) 的紊 亂 二 通過(guò)反義技術(shù)及RNA干擾技術(shù)抑制 有害基 因的表達(dá) 三 利用導(dǎo)入的外來(lái)基 因的表達(dá)產(chǎn)物 ， 彌補(bǔ)缺陷細(xì)胞 的功能等 約有 70%的基因治療臨床試 驗(yàn)應(yīng)用的是病毒載體，相比之下，非病毒型基因載體穿膜肽免疫原性較低，且價(jià)格低廉，易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，是目前被廣泛研究的一種基因載體。

【關(guān)鍵詞】基因治療;穿膜肽載體

一、引言

約有 70%的基因治療臨床試 驗(yàn)應(yīng)用的是病毒載體但病毒 載體 的應(yīng)用 仍然受到如 下 因素 的限制 制備 困難 、 目的基 因容量小 、靶 向特異性差 、 免疫原性較強(qiáng) 、易產(chǎn)生野 生型病毒等 。同時(shí) ， 在細(xì)胞水平 ， 病毒轉(zhuǎn)染后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面標(biāo)志的明顯改變 ， 致使再次應(yīng)用該類(lèi)細(xì)胞的可能性降低 。尤其是在早年美 國(guó)發(fā)生 了一起 因腺病毒介 導(dǎo)基 因治療鳥(niǎo)氨酸氨 甲酞轉(zhuǎn)移酶缺 陷癥 引起免疫并發(fā)癥死亡 的案例后所以從安全醫(yī)用的角度考慮還是不宜用于基因治療。相比之下，非病毒型基因載體免疫原性較低，且價(jià)格低廉，易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，是目前被廣泛研究的一種基因載體。

二、穿膜肽載體的作用機(jī)制

穿膜肽載體被廣泛用于遞送DNA、mRNA和雙鏈RNA這些帶有大量負(fù)電荷的水溶性大分子與各種載體結(jié)合，經(jīng)過(guò)共價(jià)鍵連接、包裹或通過(guò)靜電相互作用結(jié)合成納米顆粒等方式負(fù)載在非病毒載體上，通常形成載體/核酸復(fù)合物直徑在幾十到幾百納米不等。這些納米復(fù)合物的理化性質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率有較大影響非病毒載體/核酸復(fù)合物經(jīng)靜脈注射進(jìn)入血液循環(huán)，首先面臨的挑戰(zhàn)是在血液和細(xì)胞外間質(zhì)中各種核酸內(nèi)切酶降解。因此，非病毒載體負(fù)載核酸需要能夠保護(hù)其不被酶降解非病毒載體/核酸復(fù)合物經(jīng)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，被包裹于內(nèi)涵體（endosome）中，ATP介導(dǎo)的質(zhì)子泵作用使內(nèi)涵體和溶酶體中積累了大量的質(zhì)子，呈現(xiàn)明顯的酸性非病毒載體需要介導(dǎo)核酸分子逃逸出內(nèi)涵體，避免在內(nèi)涵體和溶酶體中降解。復(fù)合物在內(nèi)涵體中解離后基因游離到胞漿中，進(jìn)而通過(guò)胞核孔進(jìn)入核中進(jìn)行表達(dá)，最后轉(zhuǎn)錄得到蛋白質(zhì)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞及組織生長(zhǎng)。

三、穿膜肽載體轉(zhuǎn)染研究進(jìn)展

1.迄今發(fā)現(xiàn)，非病毒載體實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸的機(jī)制有兩種：一種是質(zhì)子海綿膨脹機(jī)制，利用內(nèi)涵體內(nèi)部的酸性條件，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入具有 pH緩沖作用的分子，使內(nèi)涵體不斷吸收質(zhì)子，最終漲破導(dǎo)致基因/載體復(fù)合物逃逸經(jīng)典的聚合物誘導(dǎo)的質(zhì)子海綿效應(yīng)其中核酸釋放依賴(lài)于通過(guò)聚合物和內(nèi)部?jī)?nèi)體膜的緊密結(jié)合的時(shí)間依賴(lài)性質(zhì)子化誘導(dǎo)的膜透化另一種內(nèi)涵體逃逸機(jī)制是借鑒病毒和細(xì)菌逃逸內(nèi)涵體的原理，利用疏水性基團(tuán)、雙親性結(jié)構(gòu)分子與磷脂雙層膜融合、打孔或裂解等方式實(shí)現(xiàn)。

2.反轉(zhuǎn)膠束模型中，堿性殘基會(huì)與質(zhì)膜中帶負(fù)電荷的磷脂之間相互作用，隨后疏水性殘基與膜核心的相互作用誘導(dǎo)雙分子層的擾動(dòng)，形成負(fù)曲率伴隨相鄰脂質(zhì)的重組形成反轉(zhuǎn)膠束進(jìn)而將肽包埋在內(nèi)部，膜破裂釋放肽進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)側(cè)。認(rèn)為經(jīng)典的脂質(zhì)混合機(jī)制通過(guò)脂質(zhì)復(fù)合物和宿主內(nèi)體膜的膜融合進(jìn)行，然后將帶負(fù)電荷的磷脂從細(xì)胞質(zhì)交換到內(nèi)體的內(nèi)表面。結(jié)果發(fā)生膜去穩(wěn)定化和核酸釋放。相反，脂質(zhì)混合可以起作用一種改變的機(jī)制，其中靠近內(nèi)-內(nèi)膜的脂質(zhì)復(fù)合物通過(guò)擴(kuò)散或降解失去脂質(zhì)分子。脂質(zhì)分子的釋放允許核酸的被動(dòng)釋放，隨后是由釋放的脂質(zhì)的整合導(dǎo)致的瞬時(shí)孔形成介導(dǎo)的隨后的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.所有這些模型的第一步都需要帶正電荷的CPPs與帶負(fù)電荷組分（如硫酸乙酰肝素HS和磷脂雙層）的細(xì)胞膜相互作用，使CPPs與脂質(zhì)雙分子層綁定然后導(dǎo)致質(zhì)膜的暫時(shí)不穩(wěn)定，陽(yáng)離子透膜肽介導(dǎo)核酸分子進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程如圖12所示，陽(yáng)離子透膜肽與細(xì)胞膜外帶負(fù)電荷的糖胺聚糖（GAG）基質(zhì)如肝素等結(jié)合，小部分直接轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，絕大部分插入到細(xì)胞膜經(jīng)各種蛋白（如小窩蛋白、網(wǎng)格蛋白）介導(dǎo)的內(nèi)吞或大包吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

4.小分子-CPP綴合物中的接頭的實(shí)例。用于小分子CPP的穩(wěn)定接頭包括硫醚鍵，其通過(guò)使用馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)性基團(tuán)實(shí)現(xiàn)，三唑接頭通，和酰胺鍵使用碳二亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺酯?？闪呀饷赴ㄔ谒嵝詐H下裂解的那些，例如通過(guò)醛與酰肼反應(yīng)獲得的腙鍵，和通過(guò)檸康酐與胺反應(yīng)獲得的順式酰胺連接子。還使用在還原條件下裂解的兩種硫醇之間形成的二硫化物接頭針對(duì)CPP-藥物遞送系統(tǒng)的掩蔽策略的實(shí)例由于它們的高陽(yáng)離子電荷，CPP是非特異性的內(nèi)化于許多類(lèi)型的細(xì)胞和組織中。當(dāng)與其他主動(dòng)定向方法結(jié)合使用時(shí)，這種非特異性分布可能會(huì)超過(guò)目標(biāo)識(shí)別?？朔@個(gè)問(wèn)題的一種方法是屏蔽CPP直到復(fù)何物到達(dá)的目標(biāo)站點(diǎn)寡聚精氨酸的陽(yáng)離子電荷通過(guò)蛋白酶敏感肽序列或過(guò)氧化氫敏感基團(tuán)與低聚谷氨酸的連接而被掩蓋裂解后，寡精氨酸和低聚谷氨酸解離，顯示出低聚精氨酸的陽(yáng)離子電荷或者通過(guò)與組氨酸-谷氨酸共聚物序列連接掩蔽CPP的陽(yáng)離子電荷。

四、結(jié)論

透膜肽/核酸復(fù)合物的尺寸對(duì)細(xì)胞透膜機(jī)制有較大影響，部分較小尺寸的復(fù)合物可以直接轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，而隨著復(fù)合物尺寸的增大，小窩蛋白、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和大包吞作用呈逐漸增多趨勢(shì)通過(guò)球蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將直徑約120nm的納米顆粒內(nèi)化到細(xì)胞中，通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)部化50-70nm的顆粒。通過(guò)肌動(dòng)蛋白對(duì)較大的顆粒被大胞飲作用內(nèi)化。

【參考文獻(xiàn)】

1. L. Naldini， Nature， 2015， 526， 351–360.

2. M. A. Kay， J. C. Glorioso and L. Naldini， Nat. Med.， 2001， 7， 33–40.

3. E. Ruoslahti， Adv. Mater. ， 2012， 24， 3747–3756.

4. I. M. Verma and N. Somia， Nature， 1997， 389， 239–242

5. D. Ibraheem， A. Elaissari， and H. Fessi.， Int. J. Pharm.， 2014， 459， 70–83.

6. M. A. Kay， J. C. Glorioso and L. Naldini， Nat. Med.， 2001， 7， 33–40.

7. M. A. Mintzer and E. E. Simanek， Chem. Rev.， 2009， 109， 259–302.