牛源性大腸桿菌O157:H7的分離鑒定及其耐酸性比較研究

付文靜 姬賽賽 禹金龍 張?zhí)K 徐媛媛 江蕓

摘 要：為比較大腸桿菌（Escherichia coli）O157：H7產(chǎn)毒菌株耐受鹽酸和乳酸的差異性，首先采集309 份牛糞及牛肉樣，進行菌株分離鑒定，接著采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測分離株及其他收集菌株的4 種毒力基因（eae、hly、stx1、stx2），進而對攜帶毒力基因的產(chǎn)毒菌株分別進行鹽酸和乳酸應(yīng)激實驗。結(jié)果表明：共分離鑒定出8 株大腸桿菌O157菌株，樣品陽性檢出率為2.59%;毒力基因檢測表明，8 株菌株均不攜帶stx1和stx2基因，其中6 株菌株攜帶eae及hly基因;所有產(chǎn)毒菌株耐酸性實驗結(jié)果表明，鹽酸或乳酸處理2 h后20 株產(chǎn)毒菌株存活菌數(shù)均顯著下降（P<0.05），但下降程度呈現(xiàn)明顯的菌株差異性，同一菌株對鹽酸、乳酸呈現(xiàn)明顯的耐受差異。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌O157：H7;分離鑒定;耐酸性;菌株差異;產(chǎn)毒菌株

Isolation and Identification of Escherichia coli O157：H7 from Cattle and Comparison of Their Acid Tolerance

FU Wenjing， JI Saisai， YU Jinlong， ZHANG Su， XU Yuanyuan， JIANG Yun*

（School of Food Science and Pharmaceutical Engineering， Nanjing Normal University， Nanjing 210023， China）

Abstract： To investigate the variability of the tolerance of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157：H7 to hydrochloric acid and lactic acid， suspected colonies were isolated from 309 fecal and beef samples and identified in this study. The isolates and another 14 strains collected for this study were detected for 4 major virulence genes （eae， hly， stx1， stx2） by multiplex polymerase chain reaction， and each of the Shiga toxin-producing strains with virulence genes was separately exposed to hydrochloric acid and lactic acid stress. The results showed that 8 isolates of E. coli O157 were identified and the prevalence of positive samples was 2.59%. The results of virulence genes showed that the stx1 and stx2 genes were detected in none of the 8 strains and the eae and hly genes were detected in 6 of them. The results of acid tolerance showed that the survival rates of 20 Shiga toxin-producing strains including the 6 strains and the other 14 above were all significantly decreased （P < 0.05） after treatment with hydrochloric acid or lactic acid for 2 h. However， this effect varied between strains， and the tolerance of the same strain to different acid treatments was different.

Keywords： Escherichia coli O157：H7; isolation and identification; acid tolerance; inter-strain variation; Shiga toxin-producing strains

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190619-139

中圖分類號：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）07-0001-06

引文格式：

付文靜， 姬賽賽， 禹金龍， 等. 牛源性大腸桿菌O157：H7的分離鑒定及其耐酸性比較研究[J]. 肉類研究， 2019， 33（7）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190619-139.? ? http：//www.rlyj.net.cn

FU Wenjing， JI Saisai， YU Jinlong， et al. Isolation and ientification of Escherichia coli O157：H7 from cattle and comparison of their acid tolerance[J]. Meat Research， 2019， 33（7）： 1-6. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190619-139.? ? http：//www.rlyj.net.cn

腸出血性大腸桿菌（enterohermorrhangic Escherichia coli，EHEC）是一種重要的人畜共患病原菌，也是食品中常見的食源性致病菌之一，O157：H7是其最主要的血清型[1]。大腸桿菌O157：H7感染劑量非常低，該菌吸附在宿主腸上皮細(xì)胞表面并分泌志賀毒素（shiga toxin，Stx），可引起出血性腸炎、繼發(fā)性溶血性尿毒綜合癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，重者可導(dǎo)致死亡。大腸桿菌O157：H7對人類健康的威脅已成為主要的世界性公共衛(wèi)生問題[2-3]。

許多食源性致病菌，如大腸桿菌O157：H7、傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌等均為嗜中性菌，即在中性pH值環(huán)境下最適合生長，低pH值環(huán)境不利于它們的生長繁殖，因此降低pH值是食品加工中抑制致病菌的有效措施。乳酸通常被認(rèn)為是一種安全的有機酸，歐盟委員會于2013年批準(zhǔn)乳酸用于牛胴體表面，以降低微生物污染[4]。此外，機體胃液的低pH值環(huán)境可有效殺死食源性致病菌。然而，研究表明大腸桿菌O157：H7具有較高的耐酸性，在pH 2.0～2.5的低酸環(huán)境數(shù)小時，其生長及繁殖未受到抑制[5-6]，這可能是該菌感染劑量較低的原因之一[7]。

關(guān)于酸應(yīng)激對食源性致病菌存活的影響，除了與酸種類有關(guān)外[8-9]，還與pH值、作用溫度、持續(xù)時間等密切相關(guān)[10-11]，

且無機酸（如HCl）和有機酸（如乳酸）應(yīng)激引起的微生物失活機制不同[7，12]。較多研究表明，食源性致病菌對各種應(yīng)激的耐受性存在菌株差異，而實際食品安全風(fēng)險監(jiān)測和控制的對象一般是毒力基因陽性的產(chǎn)毒菌株。因此，本研究首先從牛糞及牛肉樣中分離、鑒定大腸桿菌O157：H7，選取產(chǎn)毒菌株與前期收集的其他產(chǎn)毒菌株一起進行鹽酸和乳酸應(yīng)激處理，比較不同產(chǎn)毒菌株耐受鹽酸和乳酸的差異，為大腸桿菌O157：H7的風(fēng)險評估和科學(xué)有效控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

前期收集了14 株大腸桿菌O157：H7：其中6 株（編號分別為CICC21530、NCTC12900、89、95、JS2和JS3）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省動物源食品生產(chǎn)與安全保障重點實驗室惠贈;8 株（編號分別為D1、109、110、111、112、113、114和115）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院惠贈。另外，大腸桿菌DH5α由江蘇省疾病控制與預(yù)防中心惠贈。

改良EC肉湯（mEC+n）（modified E. coli broth）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、酵母浸粉（yeast extract，YE）及大腸桿菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒 北京陸橋技術(shù)有限公司;大腸桿菌O157和H7診斷血清、大腸桿菌O157膠體金快速檢測卡 上海慧耘生物有限公司;科馬嘉CHROMagarTM O157顯色培養(yǎng)基

上海欣中生物工程有限公司;抗E. coli O157免疫磁珠 北京東方賽瑞公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑 日本TaRaKa公司;大腸桿菌O157：H7的rfbO157、fliCH7、eae、hly、stx1和stx2引物的上、下游序列如表1所示[13-14]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

IS128C pH計 上海儀邁儀器科技有限公司;LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;ZQTY-70臺式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;Mastercycler personal PCR儀 德國Eppendorf公司;Gel Doc 2000 system凝膠成像儀 美國Bio Rad

公司;TCL-16G高速離心機 上海安亭儀器廠;2-16KL高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集安徽3 個養(yǎng)牛場的牛糞樣250 份，南京集貿(mào)市場及超市牛肉樣59 份，共309 份。每份樣品分別放入一次性自封袋內(nèi)，置于低溫冰盒內(nèi)于24 h內(nèi)送至實驗室檢測。

1.3.2 大腸桿菌O157：H7的分離、鑒定

以無菌操作取待檢樣25 g加入到含有225 mL mEC+n

肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1～2 min，于（36±1） ℃條件下培養(yǎng)24 h，參考GB 4789.36—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗》[15]，應(yīng)用免疫磁珠法富集菌株，于科瑪嘉O157顯色平板進行分離培養(yǎng)，可疑菌株進行下一步鑒定。

1.3.2.1 特異基因的PCR檢測

O157特異基因rfbO157反應(yīng)體系（25 μL）：10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、Mg2+1.5 μL、rfbO157上下游引物各0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.15 μL，ddH2O補足。rfbO157基因的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。H7特異基因fliCH7反應(yīng)體系25 μL：10×Buffer 2.5 μL、

25 mmol/L dNTP 0.5 μL、Mg2+1.5 μL、fliCH7上下游引物各0.25 μL、Taq DNA聚合酶0.125 μL，ddH2O補足。fliCH7基因的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán);72 ℃延伸5 min。引物序列及擴增片段大小如表1所示。

1.3.2.2 生化鑒定

對O157特異基因rfbO157PCR反應(yīng)為陽性的可疑菌株，采用北京陸橋公司的DBI-06大腸埃希氏菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。

1.3.2.3 血清學(xué)鑒定

對O157特異基因rfbO157 PCR反應(yīng)為陽性的可疑菌株，用O157和H7診斷血清作玻片凝集實驗。對于H7因子血清不凝集者，穿刺接種半固體瓊脂，檢查動力，經(jīng)連續(xù)傳代3 次，動力實驗均為陰性，確定為無動力株。

1.3.2.4 免疫膠體金快速檢測

對O157特異基因rfbO157 PCR反應(yīng)為陽性的可疑菌株，采用上?；墼殴镜腜rajina大腸桿菌O157快速檢測卡進行鑒定。

1.3.3 毒力基因檢測

對前期收集的14 株及上述分離鑒定的菌株進行4 種毒力基因（stx1、stx2、eae、hly）多重PCR擴增，以大腸桿菌CICC21530為陽性對照，以大腸桿菌DH5α為陰性對照，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10×Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、25 mmol/L Mg2+5 μL、eae上下游引物各1.5 μL、hly上下游引物各0.2 μL、stx1上下游引物各0.8 μL、stx2上下游引物各2.2 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O補足。四重PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，25 個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.3.4 產(chǎn)毒菌株耐酸性比較實驗

根據(jù)毒力基因檢測結(jié)果，選取毒力基因陽性菌株分別進行鹽酸、乳酸耐受性比較。

菌液制備：將本實驗室分離鑒定的菌株及購買和收集的菌株經(jīng)TSA劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB中，37 ℃培養(yǎng)18 h，再轉(zhuǎn)接至100 mL TSB中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。

鹽酸和乳酸應(yīng)激處理：預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，采用鹽酸酸化的TSB（pH 3.5）處理菌液時，細(xì)菌存活率均較高，故進一步采用鹽酸酸化的TSB（pH 2.0，模擬胃酸）、乳酸酸化的TSB（pH 3.5，模擬一些酸性食品）進行酸應(yīng)激實驗。

取活化2 次后的穩(wěn)定期菌液10 mL（約

9（lg（CFU/mL））），于4 ℃、9 000×g條件下離心5 min，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）

（pH 7.2）洗滌2 次，菌體沉淀分別重懸于等體積的鹽酸酸化的TSB（pH 2.0）和乳酸酸化的TSB（pH 3.5）中，37 ℃應(yīng)激反應(yīng)2 h，立即于上述條件下離心，沉淀用PBS洗滌重懸（終止酸應(yīng)激）[16]，用TSA-YE進行培養(yǎng)計數(shù)。實驗重復(fù)3 次，取平均值，按照下式進一步計算存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

菌株存活數(shù)用lg（CFU/mL）表示，采用SPSS V17.0 軟件進行單因素方差分析，結(jié)果顯著性使用Duncans多重比較檢驗，P<0.05表示存在顯著性差異。酸應(yīng)激后菌株存活率采用GraphPad Prism 7軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初步鑒定

大腸桿菌O157：H7在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上呈淺紅色至淡紫色，中心灰褐色。大腸菌群呈鐵藍色，變形桿菌等為無色至灰色。結(jié)果表明，309 份樣品中存在疑似菌株的有8 份，其中7 份為牛糞樣，1 份為牛肉樣。分離純化得到的疑似菌株進行下一步鑒定。

2.2 基因rfbO157和fliCH7的PCR擴增

采用PCR方法對疑似菌株進行O型和H型鑒定，以大腸桿菌CICC21530為陽性對照菌株，結(jié)果如圖1～2所示，8 株菌的rfbO157基因均為陽性，其中6 株fliCH7基因陽性，2 株fliCH7基因陰性（菌株J29和菌株2G）。表明8 株菌鑒定為大腸桿菌O157，其中6 株菌為大腸桿菌O157：H7。

泳道1. 100 bp Ladder Marker;2. 陽性對照（大腸桿菌CICC21530）;3. 陰性對照;4～11. 可疑菌株（編號依次為231、232、236、237、241、J29、J42及2G）。圖2同。

2.3 生化鑒定結(jié)果

上述8 株菌株進一步用大腸桿菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒進行生化鑒定，結(jié)果表明：8 株菌株均能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇;發(fā)酵蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;M-R實驗、吲哚實驗陽性;VP實驗、檸檬酸鹽利用實驗陰性;不產(chǎn)生硫化氫。以上生化結(jié)果與大腸桿菌O157的生化特性相符合。

2.4 血清學(xué)鑒定結(jié)果

對PCR鑒定得到的8 株菌進行血清學(xué)鑒定，以菌株CICC21530為陽性對照，結(jié)果表明，8 株菌均可與O157診斷血清發(fā)生凝集，其中有6 株可與H7診斷血清發(fā)生凝集，2 株與H7診斷血清不發(fā)生凝集（菌株J29和菌株2G），血清學(xué)實驗結(jié)果與PCR鑒定結(jié)果一致。

2.5 免疫膠體金快速檢測結(jié)果

采用大腸桿菌O157膠體金快速檢測卡對上述8 株菌株進一步進行檢測，以菌株CICC21530為陽性對照。陽性結(jié)果：C線顯色，T線肉眼可見;陰性結(jié)果：C線顯色，T線不顯色。結(jié)果表明，8 株菌均呈陽性，與rfbO157基因的PCR鑒定結(jié)果（圖1）一致。部分菌株檢測結(jié)果如圖3所示。

綜合以上實驗結(jié)果，本研究檢出大腸桿菌O157陽性的樣品共8 份，陽性檢出率為2.59%（8/309），其中牛糞陽性檢出率為2.80%（7/250），牛肉陽性檢出率為1.69%（1/59），牛糞陽性檢出率高于牛肉。陳雅君等[17]報道，糞便樣中陽性檢出率為0.67%，而牛乳和鮮肉中陽性檢出率為0%。Uhitil等[18]也報道，在牛肉和牛肉制品中沒有檢測到大腸桿菌O157。然而，另一些研究報道，在南非和馬來西亞的牛肉樣中，大腸桿菌O157陽性檢出率分別為74.5%和36.0%[19-20]，顯著高于本研究中牛肉樣的陽性檢出率。楊一群等[21]也報道，117 份食品樣中有55 份為rfbO157基因陽性，即大腸桿菌O157陽性檢出率高達47.01%。上述研究報道的差異與地區(qū)、牛群飼養(yǎng)管理、屠宰環(huán)境及屠宰工藝等有關(guān)。本研究的牛肉中檢出大腸桿菌O157，提示應(yīng)在加強防控大腸桿菌O157糞源污染的同時，更應(yīng)高度關(guān)注生肉及相關(guān)食品中致病菌的安全監(jiān)測。

2.6 毒力基因檢測結(jié)果

泳道1、26. 100 bp Ladder Marker;泳道2、27. 陽性對照（大腸桿菌CICC21530）;泳道3、28. 陰性對照（大腸桿菌DH5α）;泳道4～25. 待測菌株（編號依次為95、D1、241、241、NCTC12900、110、231、114、111、JS2、232、232、115、89、237、237、236、113、112、109、JS3和2G）;泳道29. 菌株J29;泳道30. 待測菌株J42;泳道31. 空白對照。

上述分離得到的8 株大腸桿菌O157，以菌株CICC21530為陽性對照，以菌株DH5α為陰性對照，采用多重PCR擴增4 種毒力基因。由圖4和表2可知，8 株菌株均呈stx1和stx2基因陰性，6 株菌株呈eae和hly基因陽性，菌株J29和2G這2 株H7陰性的O157菌株4 種毒力基因均呈陰性。Sallam等[22]報道，在不同的研究中，大多數(shù)大腸桿菌O157：H7均攜帶eae基因，甚至有一些研究發(fā)現(xiàn)所有分離株均攜帶eae和hly基因[23-24]。本研究也表明，大多數(shù)分離株攜帶eae和hly基因，但均不攜帶stx基因，表明未分離到產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌。Lorenz等[25]研究表明，hly基因?qū)Υ竽c桿菌O157：H7存在志賀毒素是一個很好的流行病學(xué)標(biāo)記。因此，不能忽視攜帶eae和hly基因大腸桿菌O157：H7的污染。

對本實驗室前期收集的14 株大腸桿菌O157也進行了4 種毒力基因的多重PCR擴增，由圖4和表3可知，菌株CICC21530和D1的4 種毒力基因均呈陽性，菌株95的stx1和eae基因呈陽性，菌株NCTC12900、JS2、JS3、89的eae及hly基因呈陽性，其他7 株菌株的stx2、eae及hly基因呈陽性。

2.7 不同產(chǎn)毒菌株耐酸性比較實驗結(jié)果

對上述分離鑒定的6 株產(chǎn)毒大腸桿菌O157：H7和前期收集的14 株產(chǎn)毒菌株，共20 株菌株進行鹽酸（pH 2.0）和乳酸（pH 3.5）耐受實驗。

由圖5可知，鹽酸處理2 h后20 株菌株的存活菌數(shù)均顯著下降（P<0.05），下降程度呈現(xiàn)明顯菌株差異性，存活菌數(shù)下降1.52～4.62 （lg（CFU/mL）），從菌株CICC21530到菌株J42下降程度逐漸增大。進一步計算存活率，由圖7可知，菌株CICC21530存活率最高（3.0%），菌株J42存活率最低。

由圖6～7可知，乳酸處理2 h后20 株菌株的存活菌數(shù)均顯著下降（P<0.05），但與鹽酸應(yīng)激結(jié)果差異明顯，從菌株CICC21530到菌株J42存活菌數(shù)下降程度呈現(xiàn)波動變化，其中菌株231下降程度最?。?.44 （lg（CFU/mL））），存活率最高（36.2%），菌株95下降程度最大（6.02 （lg（CFU/mL））），存活率最低。

綜合圖5～7可知，大腸桿菌O157：H7對鹽酸應(yīng)激和乳酸應(yīng)激的耐受存活情況明顯不同，例如，菌株241具有較高的鹽酸和乳酸應(yīng)激耐受能力，菌株CICC21530、95、D1耐受鹽酸而不耐受乳酸，菌株231、232耐受乳酸而不耐鹽酸，而菌株JS3既不耐受鹽酸也不耐受乳酸。實驗結(jié)果表明，大腸桿菌O157：H7對鹽酸和乳酸的應(yīng)激呈現(xiàn)明顯的菌株差異，而同一菌株對鹽酸、乳酸呈現(xiàn)明顯的耐受差異，這應(yīng)該與無機酸（鹽酸）和有機酸（乳酸）誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生的應(yīng)激響應(yīng)機制不同有關(guān)[7，12]。

3 結(jié) 論

從309 份牛糞及牛肉樣品中分離鑒定大腸桿菌O157：H7，通過選擇性培養(yǎng)增菌和平板分離、PCR檢測、生化鑒定、血清學(xué)方法和免疫膠體金快速檢測，共鑒定出8 株大腸桿菌O157，陽性檢出率為2.59%。采用多重PCR檢測毒力基因發(fā)現(xiàn)，8 株菌株均不攜帶stx1和stx2基因，6 株菌株呈eae及hly基因陽性。20 株產(chǎn)毒菌株經(jīng)鹽酸或乳酸處理后菌數(shù)均顯著下降，但下降程度呈現(xiàn)明顯的菌株差異性，而同一菌株對鹽酸、乳酸呈現(xiàn)明顯的耐受差異性。本實驗結(jié)果提示，應(yīng)加強環(huán)境和食品中大腸桿菌O157：H7的監(jiān)測和控制，更應(yīng)重視產(chǎn)毒菌株應(yīng)激耐受差異的存在，以保證其風(fēng)險評估和控制更加科學(xué)有效。

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