鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF72基因克隆、蛋白原核表達(dá)和抗體制備

李雙 向濤 周海峰

摘要：異育銀鯽作為我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，其鰓出血病為主要病害，并造成重大經(jīng)濟(jì)損失，該病病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型（cyprinid herpesvirus Ⅱ，CyHV-2）。目前，研究主要在該病的檢測和病理方面，對于免疫學(xué)檢測方面研究較少。本研究根據(jù)CyHV-2 ORF72基因序列設(shè)計(jì)了1對特異性引物，利用患病異育銀鯽腎臟DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增得到CyHV-2 ORF72基因全長，該基因序列全長為1 113 bp，可編碼370個(gè)氨基酸的蛋白。該基因與pET-28a表達(dá)載體連接構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-ORF72轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到了分子量約為45 ku的重組蛋白，與預(yù)測的蛋白大小基本一致。將純化的重組蛋白皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大耳兔制備了ORF72的多克隆抗體，經(jīng)Western Blotting檢測抗體能與病毒粗提液有良好反應(yīng)，特異性較好，本結(jié)果可為下一步建立疫苗和免疫檢測方法奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：異育銀鯽;鯉皰疹病毒Ⅱ型;ORF72;多克隆抗體;Western Blotting

中圖分類號：S941.41 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0062-04

鯽魚是江蘇省重要的大宗淡水養(yǎng)殖品種之一，在淡水養(yǎng)殖業(yè)中具有重要地位[1-3]。在江蘇省鯽魚精養(yǎng)面積達(dá) 533.3 km2 以上，2011年產(chǎn)量達(dá)54.80萬t，產(chǎn)值約80多億元，居全國首位。隨養(yǎng)殖集約化程度的增高、養(yǎng)殖密度的增大以及養(yǎng)殖水環(huán)境的惡化，鯽魚的病害問題也日益突出，目前已成為威脅鯽魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要因素。在這些病害中，主要以近幾年發(fā)生的鰓出血病最為嚴(yán)重。經(jīng)檢測確認(rèn)，引起這種疾病的病原是鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2），該病毒的宿主范圍較窄，僅感染金魚、鯽魚和它們的變種[4-5，8]，致死率可高達(dá)90%～100%[4]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害。

CyHV-2首次發(fā)病是在日本養(yǎng)殖的金魚中[9]，目前該病在美國[4-5]、澳大利亞[5]、我國臺灣省[8]、英國[10]等地均有發(fā)生，其流行情況分布全球。2011—2012年，CyHV-2導(dǎo)致我國養(yǎng)殖的異育銀鯽（Carassius gibelio）出現(xiàn)嚴(yán)重死亡，也是我國大陸異育銀鯽發(fā)生該病的首次報(bào)道[11]。而2013年在江蘇、北京、武漢、廣州等地養(yǎng)殖的異育銀鯽中也被檢測出了CyHV-2，說明CyHV-2在我國已有較為廣泛的分布[12]。

CyHV-2又稱金魚造血器官壞死病毒（goldfish haematopoietic necrosisvirus，GFHNV）[3，5，13-14]、皰疹病毒性造血器官壞死癥病毒（herpes viral haematopoietic necrosis virus，HVHNV）[5，9]。該病毒是第2個(gè)從鯉科魚中分離出的病毒，因此，國際病毒系統(tǒng)分類與命名委員會(huì)命名其為鯉皰疹病毒Ⅱ型（cyprinid herpesvirus Ⅱ，CyHV-2）[3，14]，與鯉痘瘡病毒（carp pox herpesvirus，cyprinid herpesvirus，CyHV-1）和錦鯉皰疹病毒（koi herpesvirus，cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）統(tǒng)稱為“鯉科魚皰疹病毒目的3個(gè)型”。目前，對該病毒的研究還處于初級階段，世界動(dòng)物組織（OIE）還未將其納入檢疫目錄[12]。CyHV-2為一種線型的雙鏈DNA病毒，包含156個(gè)開放閱讀框（ORF）[1]，成熟的病毒粒子外有一層包膜，呈圓形或橢圓形，直徑可達(dá)0.175～0.200 μm[15]。目前，對該病毒的檢測方法和病理學(xué)方面的研究較多，而對其病毒的研究仍較少。分子生物學(xué)診斷方法主要是普通PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等，另外還有細(xì)胞培養(yǎng)，電鏡觀察檢測法等。然而，該病毒的免疫學(xué)研究還很少，CyHV-2抗原蛋白的表達(dá)和抗體制備處于萌芽階段?？乖鞍妆磉_(dá)和抗體制備對于有效預(yù)防和治療該病毒至關(guān)重要，可為以后該病毒相應(yīng)疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)打下堅(jiān)定地基礎(chǔ)。本研究對ORF72基因進(jìn)行原核重組表達(dá)，并構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-ORF72，且在新西蘭大耳兔中制備了該重組蛋白的多克隆抗體，為病毒的防治提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體、菌株及病毒來源

pET-28原核表達(dá)載體，購自Novagen公司，于筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transetta（DE3），購自Trangen生物公司。CyHV-2病毒從患有明顯鰓出血病癥狀的異育銀鯽中分離純化獲得，且CyHV-2 PCR檢測陽性。

1.2 試驗(yàn)試劑

DNA純化回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）、Prime star Max Premix（2×）、DL2 000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶，均購自Tiangen生物公司。Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶，均購自TaKaRa生物公司。2種弗氏佐劑（完全和不完全），購自Sigma公司，DNA蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)，購自Fermentas公司;胰蛋白胨，購自Solarbio公司;考馬斯亮藍(lán)，購自南京建成生物工程研究所;高純質(zhì)粒小量制備試劑盒，購自北京百泰克生物科技有限公司;LB營養(yǎng)瓊脂，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)CyHV-2 ORF72基因序列，利用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)的引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。

1.4 CyHV-2 ORF72基因擴(kuò)增

使用DNA提取試劑盒，根據(jù)說明書操作步驟提取患病異育銀鯽腎臟總DNA作為擴(kuò)增模板。25 μL PCR反應(yīng)體系：滅菌雙蒸水9.5 μL，10 μmol/L上下游引物各自1 μL，DNA模板1 μL，Prime star Max Premix （2×）12.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性4 min;98 ℃變性10 s，55 ℃退火 5 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。將擴(kuò)增完的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及篩選

將擴(kuò)增的目的片段和pET-28a運(yùn)用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用膠回收試劑盒對DNA進(jìn)行回收和純化。之后T4連接酶將兩者連接構(gòu)成重組質(zhì)粒pET-ORF72。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E. coli Trans1 T1中，經(jīng)PCR、酶切鑒定和測序以確定讀碼框正確無誤。

1.6 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)及重組蛋白的純化

將篩選出測序正確的陽性重組質(zhì)粒pET-ORF72轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21中，培養(yǎng)至D600 nm為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，離心收集菌液，經(jīng)超聲波破碎裂解后離心出上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，最后采用His-tag親和層析柱按照說明書步驟對目的蛋白進(jìn)行純化。

1.7 Western blot檢測

將病毒粗提液先進(jìn)行SDS-PAGE電泳;然后取出凝膠置于緩沖液中平衡10～15 min;剪出和膠同等大小的PVDF膜和濾紙，用甲醇浸潤膜20 s，再用無菌水浸洗2 min，再與濾紙一起放轉(zhuǎn)移平衡液中平衡20 min;負(fù)極向正極轉(zhuǎn)膜，按順序放置好3層濾紙、凝膠、3層PVDF膜，注意避免產(chǎn)生氣泡;將組裝好的槽心裝入轉(zhuǎn)移裝置后加入充足轉(zhuǎn)移緩沖液，冰浴條件下250～300 mA轉(zhuǎn)移90～100 min;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜置于平皿中，用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h;用TBST每隔10 min洗1次，共洗4次后加入ORF72多克隆抗體，4 ℃孵育過夜;再用TBST同上洗滌4次后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體室溫下孵育1 h;洗滌4次后用顯色劑顯色后將膜放入雙蒸水中終止反應(yīng)，最后用凝膠成像儀進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增

利用患病異育銀鯽腎臟提取的CyHV-2 DNA作為擴(kuò)增模板，使用設(shè)計(jì)的相應(yīng)特異性引物（表1），通過PCR擴(kuò)增得到CyHV-2 ORF72目的基因。CyHV-2 ORF72基因序列全長為1 113 bp，其長度和預(yù)期一致（圖1）。

2.2 CyHV-2 ORF72重組蛋白的表達(dá)

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中，誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)后使其終濃度為238.30 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌6 h后超聲破碎離心出上清和沉淀后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析。由圖2可知，重組融合蛋白ORF72表達(dá)明顯，可誘導(dǎo)出分子量約為45 ku（1 u=1 g/mol）的重組蛋白， 與預(yù)測蛋白大小基本一致;在沒有IPTG劑誘導(dǎo)時(shí)，目的蛋白不表達(dá)。

2.3 CyHV-2 ORF72重組蛋白的純化

利用親和層析法對重組表達(dá)的CyHV-2 ORF72蛋白進(jìn)行純化，將收集到的穿透液和洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析（圖3）。目的蛋白進(jìn)行純化后濃度較高，且分子量為 45 ku 處得到單一條帶。

2.4 CyHV-2 ORF72純化蛋白多克隆抗體的Western blot驗(yàn)證

利用純化的原核重組ORF72蛋白，與佐劑等量混合后分4次腹部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大耳兔，每次間隔1周，以制備ORF72的多克隆抗體，并利用Western blotting方法檢測純化的ORF72的多克隆抗體效果，結(jié)果顯示制備的多克隆抗體能與病毒粗提液有良好的反應(yīng)。由圖4可知，其特異性好，可見單一條帶，為后續(xù)建立免疫檢測方法奠定了一定基礎(chǔ)。

3 討論

異育銀鯽具有生長快、食性雜、易飼養(yǎng)、肉質(zhì)鮮美、蛋白質(zhì)豐富等優(yōu)點(diǎn)，受到廣大消費(fèi)者的青睞，成為主要淡水經(jīng)濟(jì)魚類。隨著養(yǎng)殖密度的加大和水環(huán)境的管理欠缺，病害發(fā)生越來越多，制約了異育銀鯽的發(fā)展，影響了社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。異育銀鯽的常見病害主要有細(xì)菌性疾病，如細(xì)菌性敗血癥[16]等;真菌性疾病，如水霉病[17]等;寄生蟲病，如黏孢子蟲病[18]等。近年來，異育銀鯽鰓出血病發(fā)病頻繁，成為其主要病害。2011年至今，鰓出血病以極快的速度蔓延，發(fā)病死亡面積已達(dá)到約66.67 km2，造成的經(jīng)濟(jì)損失已達(dá)數(shù)億元。2012年[11]和2013年[2]經(jīng)現(xiàn)場診斷調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室病原分離與鑒定研究，獲得人工感染試驗(yàn)、組織病理學(xué)、超薄切片電鏡觀察、分子診斷、病毒培養(yǎng)等關(guān)鍵性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確認(rèn)近年在我國江蘇大部分地區(qū)暴發(fā)的養(yǎng)殖鯽魚出血病為皰疹病毒性造血器官壞死癥，其病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）。

目前，病毒檢測的主要手段為PCR，CyHV-2的PCR檢測方法已有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[20]、微滴式數(shù)字快速PCR檢測方法[21]、雙重快速PCR[22]、Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR[23-24]。另外，薛忠儀等運(yùn)用chelex建立了一種快速檢測該病毒的PCR方法[17]。除PCR檢測法外，還有電鏡觀察、細(xì)胞培養(yǎng)的方法去檢測病毒的存在。電鏡觀察法比較直觀，能夠直接看到患病魚體組織內(nèi)病毒的有無。Jung等通過電鏡技術(shù)首次觀察到了患病金魚脾、腎組織細(xì)胞中感染的CyHV-2粒子[9];Groff等采用電鏡觀察瀕死金魚幼魚的鰓和腎組織的超薄切片，也證實(shí)了感染細(xì)胞內(nèi)CyHV-2粒子的存在[10];Chang等通過電鏡技術(shù)也在瀕死的金魚組織細(xì)胞內(nèi)觀察到CyHV-2粒子[8]。Wang等通過電鏡發(fā)現(xiàn)在肝和脾能觀察到最明顯的組織病理學(xué)變化[10]。Wu等通過電鏡也發(fā)現(xiàn)了患病魚腎、脾、肝、鰓、腸道等組織的不同損傷和壞死[2]。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前用到的不多，由于CyHV-2通過細(xì)胞培養(yǎng)繁殖幾代后就失去其活性，所以很難在魚類病毒分離常用的細(xì)胞系中進(jìn)行增殖傳代，一般傳3～4代就會(huì)失去活性，馬杰等建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型敏感的異育銀鯽腦組織細(xì)胞系，CyHV-2在GiCB細(xì)胞上連續(xù)傳代到第6代仍可檢測到病毒核酸且病變穩(wěn)定[25]。

目前，對CyHV-2的免疫學(xué)檢測相關(guān)的研究還較少，因此免疫學(xué)研究更有意義，可篩選出病毒相關(guān)蛋白制備出相應(yīng)抗體，為病毒疫苗的商業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，能夠有效解決病毒的危害問題。彭俊杰等原核表達(dá)了ORF25蛋白及制備了其單克隆抗體[15];周勇等原核表達(dá)了ORF4蛋白并制備了其多克隆抗體，并用ELISA和間接免疫熒光檢測了抗體可以和該病毒良好地特異性結(jié)合[3];廖紅等成功克隆了ORF5截短基因并且成功原核表達(dá)出蛋白，通過攻毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該融合蛋白具有一定的免疫原性[1]。本研究利用CyHV-2-ORF72基因設(shè)計(jì)出其特異性引物進(jìn)行了基因的克隆、蛋白的表達(dá)和純化試驗(yàn)，并且利用新西蘭大白兔制備了多克隆抗體，并且經(jīng)Western blotting分析可見其特異性良好。本試驗(yàn)的表達(dá)系統(tǒng)為原核表達(dá)載體pET-28a和大腸桿菌，該系統(tǒng)與其他系統(tǒng)相比具有很高的表達(dá)效率，能夠良好地表達(dá)出目的蛋白，運(yùn)用的大腸桿菌具有周期短、易培養(yǎng)、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[26]。本試驗(yàn)成功表達(dá)出ORF72蛋白，并且利用該純化的蛋白免疫新西蘭大白兔獲得了抗體，為下一步組裝ELISA試劑盒和 CyHV-2 免疫膠體金試紙條奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為探討重組表達(dá)的ORF72蛋白是否能作為疫苗使用奠定了基礎(chǔ)，有利于對該病毒疫苗進(jìn)行商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，可加快對CyHV-2病毒的免疫學(xué)檢測辦法實(shí)踐于養(yǎng)殖異育銀鯽的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中可便利準(zhǔn)確檢測該病病原，并且能高效地進(jìn)行室內(nèi)室外自身檢測病原，這對于及時(shí)發(fā)現(xiàn)及治療鰓出血病，減少異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)及水產(chǎn)行業(yè)的損失，具有重大意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]廖 紅，林 華，郝中香，等. 鯉皰疹病毒2型ORF5截短基因的克隆表達(dá)及免疫原性研究[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2016（11）：1394-1400.

[2]Wu T，Ding Z F，Ren M，et al. The histo- and ultra-pathological studies on a fatal disease of Prussian carp （Carassius gibelio） in mainland China associated with cyprinid herpesvirus 2 （CyHV-2）[J]. Aquaculture，2013，412（6）：8-13.

[3]周 勇，范玉頂，徐 進(jìn)，等. 鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表達(dá)與免疫學(xué)檢測方法[J]. 淡水漁業(yè)，2017，47（1）：61-65.

[4]Goodwin A E，Khoo L，Lapatra S E，et al. Goldfish hematopoietic necrosis herpesvirus（cyprinid herpesvirus 2）in the USA：molecular confirmation of isolates from diseased fish[J]. Journal of Aquatic Animal Health，2006，18（1）：11-18.

[5]Stephens F J，Raidal S R，Jones B. Haematopoietic necrosis in a goldfish （Carassius auratus） associated with an agent morphologically similar to herpesvirus[J]. Australian Veterinary Journal，2004，82（3）：167-169.

[6]Luo Y Z，Lin L，Liu Y，et al. Haematopoietic necrosis of cultured Silver prussian carp（Carassius gibelio）associated with cyprinid herpesvirus[J]. Journal of Fish Diseases，2013，36（12）：1035-1039.

[7]Xu J，Zeng L，Zhang H，et al. Cyprinid herpesvirus 2 infection emerged in cultured gibel carp，Carassius auratus gibelio，in China[J]. Veterinary Microbiology，2013，166（1/2）：138-144.

[8]Chang P H，Lee S H，Chiang H C，et al. Epizootic of herpes-like virus infection in goldfish，Carassius auratus in Taiwan[J]. Fish Pathology，1999，34（4）：209-210.

[9]Jung S J，Miyazaki T. Herpesviral haematopoietic necrosis of goldfish，Carassius auratus （L.）[J]. Journal of Fish Diseases，1995，18（3）：211-220.

[10]Jeffery K R，Bateman K，Bayley A，et al. Isolation of a cyprinid herpesvirus 2 from goldfish，Carassius auratus （L.），in the UK[J]. Journal of Fish Diseases，2007，30（11）：649-656.

[11]Wang L，He J，Liang L，et al. Mass mortality caused by cyprinid herpesvirus 2 （CyHV-2） in prussian carp （Carassius gibelio） in China[J]. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists，2012，32（5）：164-173.

[12]李莉娟，羅楊志，劉學(xué)芹，等. 金魚鯉皰疹病毒Ⅱ型的分子診斷[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（1）：92-96.

[13]Jung S J，Miyazaki T. Herpesviral haematopoietic necrosis of goldfish，Carassius auratus （L.）[J]. Journal of Fish Diseases，2010，18（3）：211-220.

[14]薛中儀，朱春艷，王 瑤，等. 一種鯉科皰疹病毒Ⅱ型的PCR快速檢測方法[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，2015，36（7）：45-48.

[15]彭俊杰，張 琪，賈路路，等. 鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）ORF25蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，36（2）：96-101.

[16]李振言. 魚類細(xì)菌性敗血癥及其防治技術(shù)[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚，2004（1）：46-46.

[17]張書俊，楊先樂，李 聃，等. 施氏鱘水霉病病原的初步研究[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2009，16（1）：89-96.

[18]徐海圣，王淑霞，吳惠仙，等. 異育銀鯽寄生黏孢子蟲病的研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），1997（3）：259-264.

[19]Ma J，Jiang N，Lapatra S E，et al. Establishment of a novel and highly permissive cell line for the efficient replication of cyprinid herpesvirus 2 （CyHV-2）[J]. Veterinary Microbiology，2015，177（3/4）：315-325.

[20]Zhang H，Zeng L B，F(xiàn)an Y D，et al. A Loop-Mediated isothermal amplification assay for rapid detection of cyprinid herpesvirus 2 in gibel carp （Carassius auratus gibelio）[J]. The Scientific World Journal，2014（1）：1-6.

[21]郝中香，林 華，佘 容，等. 鯉皰疹病毒2型微滴式數(shù)字PCR快速檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2016（2）：167-173.

[22]羅 丹，梁利國，謝 駿，等. 2型鯉皰疹病毒雙重PCR快速檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36（5）：379-382.

[23]于 力，王津津，史秀杰，等. 鯉科皰疹病毒2型Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立[J]. 中國動(dòng)物檢疫，2015（10）：80-84.

[24]周 勇，曾令兵，張 輝，等. 鯉皰疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2013，37（4）：607-613.

[25]Ma J，Jiang N，Lapatra S E，et al. Establishment of a novel and highly permissive cell line for the efficient replication of cyprinid herpesvirus 2 （CyHV-2）[J]. Veterinary Microbiology，2015，177（3/4）：315-325.

[26]喬 寧，李美芹，劉永光，等. 番茄黃化曲葉病毒CP基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建選擇[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（7）：3901-3902，3905.

[27]王世會(huì)，賈智英，李池陶，等. 錦鯉皰疹病毒ORF72基因克隆及結(jié)構(gòu)功能分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志，2016，29（3）：9-15.