純牛乳中硫氰酸鈉高通量快速檢測方法的建立

穆洪濤,賀帆麗,王 宇,劉鳳銀,曾思敏,梁 岳,李曉珺,鄒紅麗,馮麗娜

(1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,廣東廣州 510303; 2.廣州市食品檢驗所,廣東廣州 511400)

硫氰酸鈉(NaSCN,Sodium thiocyanate)是一種化工原料,常被用于醫(yī)藥、印染等多種行業(yè),同時具有一定的防腐功能,在牛乳中添加一定量的硫氰酸鈉可達到抑菌、保鮮及延長牛乳保質(zhì)期的目的[1-2]。但硫氰酸鈉對人體有一定的毒害作用,過量攝入可引起急性毒性,主要表現(xiàn)有惡心、嘔吐、昏迷、器官功能衰竭等癥狀;少量攝取可妨礙人體對碘的吸收和利用,引起甲狀腺疾病,尤其對胎兒和嬰兒的智力和神經(jīng)發(fā)育存在較大的危害[3]。

2008年12月,我國衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》中明確規(guī)定,硫氰酸鈉在乳及乳制品中屬于違法添加物質(zhì)[4]。國際食品法典委員會規(guī)定生乳中硫氰酸鈉的最高限量值為14 mg/kg。我國食品藥品監(jiān)督管理總局將液態(tài)乳品中硫氰酸鈉的風(fēng)險監(jiān)測參考值設(shè)定為10 mg/kg[5],國家食藥監(jiān)總局一直將乳品中的硫氰酸鈉作為一個監(jiān)測項目[5]。因此,發(fā)展高通量、高靈敏度的硫氰酸鈉快速檢測方法對于監(jiān)測和篩查乳及乳制品中的硫氰酸鈉殘留具有重要意義。

目前,對牛乳中硫氰酸鈉進行檢測常用的方法主要有兩大類:一類是采用高精確度的儀器進行檢測,如離子色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8]、氣相色譜法[9]、掃描拉曼高光譜法[10]等。但是使用這些方法處理樣品時間較長、步驟較復(fù)雜,對操作人員要求較高,難以滿足我國當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)和流通環(huán)節(jié)的現(xiàn)場高通量快速檢測。另一類是基于顯色的原理對硫氰酸鈉進行檢測,比較常用的是鐵鹽法,其原理是硫氰酸鈉在水溶液中可解離出硫氰酸根(SCN-),在酸性條件下可與三價鐵離子(Fe3+)反應(yīng)生成血紅色的絡(luò)合物硫氰酸鐵(Fe(SCN)3),利用分光光度法進行定性定量檢測[2]或利用目視比色法進行半定量檢測[11]。

微孔板法通常用于酶聯(lián)免疫吸附法分析目標(biāo)物的含量,具有快速、簡便、通量高等特點。因微孔板法優(yōu)點顯著,故被用于總黃酮含量測定[12]、藻類細(xì)胞培養(yǎng)[13]、亞硝酸鹽含量測定[14]等領(lǐng)域。

本研究基于SCN-與 Fe3+反應(yīng)生成血紅色絡(luò)合物的原理,以微孔板作為顯色載體,通過顯色劑篩選、顯色條件優(yōu)化、方法評價等步驟開發(fā)出一種準(zhǔn)確、快速、簡便和高通量的純牛乳中硫氰酸鈉含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽酸、硝酸、硫酸、高氯酸、氯化鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、高氯酸鐵、硫酸鐵銨、硫氰酸鈉、甲醇、醋酸鉛、三氯乙酸 均為分析純，上海阿拉丁試劑公司;96孔酶標(biāo)板 廈門怡佳美實驗器材有限公司;實驗用水 為三級去離子水;全脂滅菌純牛乳硫氰酸鈉陰性樣品(經(jīng)SN/T 3927-2014離子色譜法[15]確認(rèn)) 由廣州市食品檢驗所提供。

JA2603B型分析天平(0.1 mg) 上海精科科學(xué)儀器有限公司;SP-Max 2300A2型光吸收型全波長酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 硫氰酸根標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1000 mg/L):將硫氰酸鈉固體置于烘箱中60 ℃烘干24 h,并稱取1.000 g硫氰酸鈉固體,溶解至1 L純水中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液:臨用前,準(zhǔn)確移取0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度。硫氰酸鈉質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5、10、15、20、25、30 mg/L。

顯色劑:選取5種常見的鐵鹽:高氯酸鐵(Fe(ClO4)3)、硫酸鐵(Fe2(SO4)3)、硝酸鐵(Fe(NO3)3)、三氯化鐵、硫酸鐵銨(NH4Fe(SO4)2)。用其對應(yīng)酸根陰離子所對應(yīng)的1.5 mol/L的酸溶液溶解配制成1 mol/L的鐵鹽溶液作為顯色液。

1.2.2 最佳波長的確定 使用1.2.1配制的5種1 mol/L的鐵鹽溶液0.5 mL與1.5 mL的1.0 g/L硫氰酸鈉溶液進行顯色,用紫外可見分光光度計在200～800 nm波段對溶液進行掃描,確定顯色物質(zhì)的最佳吸收波長。

1.2.3 顯色劑種類篩選 取上述5種1 mol/L鐵鹽溶液10 μL分別與0、2.5、5、10、15、20、25 mg/L的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液200 μL在96孔微孔板中進行顯色,調(diào)整酶標(biāo)儀至最佳吸收波長,測定每個微孔的吸光值,選取本底值低且擬合曲線斜率大的鐵鹽溶液作為最佳顯色劑。選取較優(yōu)的2種1 mol/L鐵鹽溶液10 μL分別與0、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10 mg/L的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液200 μL在96孔微孔板中進行顯色,進一步確定最優(yōu)顯色劑。

1.2.4 顯色劑濃度篩選 若無特殊說明以下顯色均在96孔微孔板中進行,顯色劑與硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的用量分別為10和200 μL。

將1.2.3篩選到的最優(yōu)顯色劑配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的溶液(溶劑為最佳顯色劑的酸根陰離子所對應(yīng)的1.5 mol/L的酸溶液),將不同濃度的顯色劑溶液分別于30 mg/L硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液顯色5 min,于最佳吸收波長測定反應(yīng)體系吸光值,確定顯色劑工作濃度。為進一步確認(rèn)顯色劑工作濃度,用系列濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的高氯酸鐵溶液對濃度范圍為0～60 mg/L的硫氰酸鈉溶液進行顯色,測定465 nm的吸光值,建立硫氰酸鈉濃度與吸光度間的線性關(guān)系。

1.2.5 顯色劑酸度優(yōu)化 用濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的最佳顯色劑酸根陰離子所對應(yīng)的酸溶液作為溶劑,配制顯色劑最佳工作濃度溶液。并與30 mg/L硫氰酸鈉使用液進行顯色,于最佳吸收波長處測定吸光值,選取吸光值變化趨于穩(wěn)定時對應(yīng)的酸度為最佳顯色劑酸度。

1.2.6 顯色時間優(yōu)化 向200 μL的30 mg/L硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液中加入10 μL上述步驟優(yōu)化的顯色劑(1.5 mol/L的高氯酸鐵溶液(用2.0 mol/L高氯酸溶液配制))后混勻,立即用酶標(biāo)儀在最佳吸收波長下進行30 min動力學(xué)掃描,頻率為5 s采集一次。選取吸光值趨于穩(wěn)定時對應(yīng)的時間為最佳顯色時間。

1.2.7 顯色溫度優(yōu)化 用最優(yōu)顯色劑(1.5 mol/L的高氯酸鐵溶液(用2.0 mol/L高氯酸溶液配制))分別在溫度為4、25、37、50、60 ℃的環(huán)境下對濃度為0～30 mg/L的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液進行顯色,選取顯色靈敏度高的溫度為最佳顯色溫度。

1.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用優(yōu)化后的最佳測試條件,分別測定0、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70和80 mg/kg硫氰酸鈉系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值。以硫氰酸鈉濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)零,以硫氰酸鈉的濃度為橫坐標(biāo),以465 nm下酶標(biāo)儀的讀數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 樣品前處理優(yōu)化 取4份10 mL純牛乳樣品,分別加入1 mL處理液(甲醇、50%三氯乙酸、配制最佳顯色劑所用的酸溶液(2 mol/L高氯酸)、飽和醋酸鉛溶液)進行前處理,然后10000 r/min離心 5 min,選取離心液最澄清且對顯色體系無干擾者為最佳樣品前處理劑。

1.2.10 加標(biāo)回收實驗 使用全脂滅菌純牛乳經(jīng)樣品前處理后,用本研究建立的檢測方法進行加標(biāo)回收實驗[16],硫氰酸鈉添加量分別為:1.0、5.0、10.0、20.0和80.0 mg/kg。加標(biāo)回收率的計算公式為:

加標(biāo)回收率(%)=(加標(biāo)樣品=測得目標(biāo)物總量-基質(zhì)中目標(biāo)物的量)/添加硫氰酸鈉的量×100

1.2.11 精密度檢驗 精密度是指在規(guī)定條件下對同一被測對象重復(fù)測量所得示值或被測量的量值間的一致程度[17]。向牛乳樣品中分別添加1.0、5.0、10.0、20.0和80.0 mg/kg的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品,用本研究確定的方法進行20次重復(fù)測定用以驗證本方法的精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究中數(shù)據(jù)無特殊說明均重復(fù)3次或以上,純牛乳中硫氰酸鈉數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行顯著性差異分析,數(shù)據(jù)繪圖軟件選用Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳波長的確定

對5種鐵鹽(高氯酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、三氯化鐵、硫酸鐵銨)與硫氰酸鈉的反應(yīng)溶液進行200～800 nm全波長掃描,掃描結(jié)果見圖1。由圖1可知,各顯色體系在200～800 nm波長下均出現(xiàn)三個明顯的吸收峰:230、249和465 nm。其中230和249 nm處的兩個峰很可能為硫氰酸根離子中碳氮三鍵(S-C≡N)-的紫外吸收引起的,但因其峰強度與濃度變化之間的線性關(guān)系不明顯,故不用此二峰進行硫氰酸鐵的定量分析。另外波長位于465 nm處的峰強與濃度變化呈明顯的線性關(guān)系,為硫氰酸鐵絡(luò)合物的特征峰[2]。即硫氰酸鐵絡(luò)合物的最佳吸收波長為465 nm。

圖1 5種不同顯色體系全波長掃描結(jié)果Fig.1 Full wavelength scanning result of chromogenic solution

2.2 顯色劑種類篩選

用5種鐵鹽溶液分別與0～25 mg/L的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液進行顯色,于465 nm的波長下測定吸光值,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,各種顯色劑擬合曲線的回歸系數(shù)(R2)無顯著差異(硝酸鐵0.99677、高氯酸鐵0.99767、三氯化鐵0.99845、硫酸鐵銨0.99691、硫酸鐵0.99534)。在分光光度分析方法中,標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率表示的意義為單位濃度變化所引起的吸光值的變化。由此可知,相同條件下,斜率值越大說明此方法單位濃度的吸光值變化越靈敏。顯色劑本身的本底值越低,試劑本底值對顯色的影響就越小。故選擇斜率值較大本底值較低的顯色劑作為工作顯色劑。5種顯色體系標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率由高到低依次為:硝酸鐵(0.038)、高氯酸鐵(0.036)、三氯化鐵(0.025)、硫酸鐵銨(0.012)、硫酸鐵(0.010)。其中硝酸鐵體系與高氯酸鐵體系的斜率接近,信號響應(yīng)最為靈敏。各顯色劑的本底吸光度分別為:硝酸鐵0.15、高氯酸鐵0.11、三氯化鐵0.17、硫酸鐵銨0.10、硫酸鐵0.09,其中以高氯酸鐵、硫酸鐵銨和硫酸鐵的本底值最低。經(jīng)初步篩選,將硝酸鐵體系與高氯酸鐵體系作為進一步實驗對象。

圖2 不同顯色體系顯色擬合曲線Fig.2 Fitting curves of different chromogenic agents’reactions

為了進一步了解硝酸鐵與高氯酸鐵的顯色效果差異,使用兩者分別對0～10 mg/L 的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液進行顯色,于最佳波長下測定吸光值,結(jié)果見圖3。在0～10 mg/L的硫氰酸鈉質(zhì)量濃度范圍內(nèi),高氯酸鐵體系擬合曲線斜率為0.0328,硝酸鐵體系曲線斜率為0.0292,高氯酸鐵的信號響應(yīng)靈敏度稍高于硝酸鐵,但兩者無顯著性差異(P>0.05)。高氯酸鐵體系的本底吸光值(0.0964)極顯著小于硝酸鐵體系本底吸光值(0.1560)(P<0.01),為了最大地減少顯色劑本身的顏色對顯色體系的影響,本研究選取高氯酸鐵為最佳顯色劑。

圖3 顯色劑高氯酸鐵、硝酸鐵與硫氰酸鈉顯色擬合曲線(n=3)Fig.3 Fitting curves of ferric perchlorate, iron nitrate color reactions(n=3)

2.3 顯色劑濃度篩選

選取高氯酸鐵為顯色試劑,其與硫氰酸鈉反應(yīng)的濃度與吸光值的關(guān)系見圖4。隨高氯酸鐵濃度的增加吸光值(A465 nm)呈緩慢上升趨勢,在濃度達到1.5 mol/L時吸光值變化趨于平緩,濃度為1.0、1.5和2.0 mol/L時A465 nm分別為1.130、1.233和1.268,經(jīng)顯著性分析得濃度為1.0、1.5 mol/L時吸光值差異顯著(P<0.05),濃度為1.5、2.0 mol/L時吸光值差異不顯著(P>0.05),故初步選擇1.5 mol/L為高氯酸鐵工作濃度。造成此趨勢的原因為:高氯酸鐵濃度在0.5～1.5 mol/L時,30 mg/L硫氰酸鈉是相對過量的,在此范圍內(nèi)增加高氯酸鐵的濃度會使吸光值上升。當(dāng)高氯酸鐵濃度達到1.5 mol/L后,高氯酸鐵相對過量,此時硫氰酸鈉的含量成為吸光值提高的制約因素,故吸光值變化趨勢不明顯。由此表明高氯酸鐵濃度在1.5 mol/L時對30 mg/L的硫氰酸鈉充分顯色。

圖4 不同濃度高氯酸鐵溶液與30 mg/L硫氰酸鈉反應(yīng)的吸光值影響(n=3)Fig.4 Chromogenic absorbance of 30 mg/L sodium thiocyanate with different concentration chromogenic agents(n=3)

為保證選取的高氯酸鐵濃度為最佳,用系列濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的高氯酸鐵溶液對濃度范圍為0～60 mg/L的硫氰酸鈉溶液進行顯色,于465 nm下測定,結(jié)果如圖5。隨高氯酸鐵溶液濃度增加,其與硫氰酸鈉的擬合曲線斜率和空白本底值都所增加(0.5 mol/L的斜率和空白本地值分別為0.0321、0.0625;1.0 mol/L的分別為0.0337、0.0747;1.5 mol/L的分別為0.0350、0.1034;2.0 mol/L的分別為0.0354、0.1316;2.5 mol/L的分別為0.0357、0.2063)。高氯酸鐵溶液濃度選擇原則為在穩(wěn)定性和擬合斜率較高,空白本底值較低為最佳。另外考慮到高氯酸鐵濃度越高試劑成本也越高,故選擇1.5 mol/L為高氯酸鐵工作濃度。

圖5 不同濃度高氯酸鐵溶液對擬合曲線斜率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of ferric perchlorate solution on the slope of fitting curves

2.4 顯色劑酸度優(yōu)化

SCN-與 Fe3+的反應(yīng)為可逆反應(yīng),Fe3+極易發(fā)生水解,從而增加顯色本底值的影響。0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的高氯酸對吸光值的影響如圖6。由圖可知在2.0 mol/L高氯酸濃度時(即d點)顯色吸光值達到峰值(1.2152±0.0228)。高氯酸濃度2.0 mol/L時的吸光值(1.2152±0.0228)與相鄰濃度2.5 mol/L時的(1.0991±0.0287)和1.0 mol/L時的(1.1043±0.0409)差異均顯著(P<0.05),與濃度為1.5 mol/L時的(1.1693±0.0414)相比,2.0 mol/L時的吸光值稍高,但差異未達到顯著水平(P>0.05)。綜合考慮選擇高氯酸濃度2.0 mol/L為其工作濃度。

圖6所示,吸光值隨著酸度的增大而增大,在 2.0 mol/L 高氯酸濃度時顯色吸光值達到峰值,之后有所下降。吸光值下降的可能原因是:當(dāng)反應(yīng)溶液過酸,溶液中有大量的H+,會使可逆反應(yīng)中:Fe3++3SCN-Fe(SCN)3的SCN-形成HSCN分子,導(dǎo)致SCN-減少,使可逆反應(yīng)向生成SCN-的方向移動,而導(dǎo)致Fe(SCN)3減少,反應(yīng)體系顏色變淺,吸光值減小。

圖6 不同酸度對吸光值的影響(n=3)Fig.6 Influence of different acidity on color rendering effect(n=3)

2.5 顯色時間優(yōu)化

顯色時間過短,會導(dǎo)致顯色不充分,從而影響檢測結(jié)果,顯色時間過長,會降低檢測的效率。本研究對30 mg/L 硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液顯色后用酶標(biāo)儀在465 nm波長下以每5 s間隔記錄一個吸光值數(shù)據(jù),獲得1800 s(30 min)內(nèi)的動力學(xué)掃描圖,結(jié)果如圖7。由圖7可知顯色反應(yīng)在30 min內(nèi)呈直線型緩慢上升,顯色開始和顯色1800 s吸光值分別為1.1578和1.2721,差異顯著(P<0.05)。延長顯示反應(yīng)時間雖然能提高吸光值,但需要耗費大量的測試時間。由于吸光值隨反應(yīng)時間變化勻速且緩慢,從快速測定方法的時間因素考慮,本研究選擇反應(yīng)300 s(即5 min)作為顯色反應(yīng)時間。

圖7 吸光值與時間的關(guān)系Fig.7 Relationship between absorption and time

2.6 顯色溫度優(yōu)化

本研究分別以2.5、5、10、15、20、25、30 mg/L的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液考察了在4、25、37、50、60 ℃五種溫度環(huán)境對顯色體系的影響,用酶標(biāo)儀在465 nm波長下進行3次平行測定,結(jié)果如圖8。不同顯色溫度下的吸光值變化曲線基本重合,顯色溫度對顯色結(jié)果影響不顯著(P>0.05)。可能原因是本體系的顯色反應(yīng)速率在較低的溫度下即可正常進行,實驗中選用的溫度梯度均在其高速反應(yīng)的階段。為了使檢測方便易操作,本方法選擇反應(yīng)溫度為室溫25 ℃。

圖8 溫度對吸光值的影響Fig.8 The effect of temperature on light absorption

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)以上優(yōu)化試驗獲得方法最佳工作條件為:1.5 mol/L的高氯酸鐵溶液(用2.0 mol/L高氯酸溶液配制)作為最佳顯色劑,室溫25 ℃下反應(yīng)5 min,用酶標(biāo)儀讀取465 nm波長下的吸收值,標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果如圖9。由線性擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.00945x+0.00099,R2=0.9997。此方法能夠滿足國標(biāo)GB/T 27404-2008“實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測”中對相關(guān)系數(shù)的要求,能夠滿足當(dāng)前對純牛乳中硫氰酸鈉殘留的日?？焖贆z測方法的要求。

通過測定20個標(biāo)準(zhǔn)零濃度,計算所有標(biāo)準(zhǔn)零濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差,以3倍(S/N=3)標(biāo)準(zhǔn)零濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為最低檢出限,為0.27 mg/kg。用10倍標(biāo)準(zhǔn)零濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為最低定量限,為0.9 mg/kg。如圖9所示,曲線在硫氰酸鈉量濃度為80 mg/L時彎曲開始出現(xiàn)平臺,故本方法線性范圍的最大值為80 mg/kg。方法的檢測線性范圍為0.9～80 mg/kg。此方法的檢測靈敏度和線性范圍能夠滿足生鮮牛乳市場對硫氰酸鈉的篩查要求。

圖9 硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Sodium thiocyanate standard curve

2.8 樣品空白前處理優(yōu)化

取10 mL純牛乳樣品加入1 mL處理液,振蕩后以10000 r/min速度離心5 min。甲醇處理純牛乳無法離心得到澄清液,50%三氯乙酸、2 mol/L高氯酸、飽和醋酸鉛溶液處理后的純牛乳均可在離心后得到澄清液,但在澄清液液面會形成一層蛋白薄膜,較難取出中間的澄清液。故本實驗采用過濾方法獲得處理樣澄清液。

采用過濾方法,甲醇處理樣品仍無法獲得澄清液。用50%三氯乙酸處理劑、1.5 mol/L高氯酸鐵與2 mol/L高氯酸處理劑、飽和醋酸鉛處理劑進行顯色反應(yīng),結(jié)果顯示飽和醋酸鉛會對本體系顯色呈棕紅色,從而造成顯色干擾;高氯酸處理劑、50%三氯乙酸處理劑與顯色劑不發(fā)生任何顏色變化,不會對本體系顯色造成干擾(圖10)。為了更好的保證顯色體系的準(zhǔn)確性,因2 mol/L高氯酸為顯色劑中的成分,無需另外添加其他試劑,故樣品前處理使用2 mol/L高氯酸進行。

圖10 不同澄清劑對顯色體系的影響Fig.10 Effects of different clarifying agents on the color developing system

2.9 樣品加標(biāo)回收實驗

加標(biāo)回收實驗所采用的樣本為全脂滅菌純牛乳,其本身所含有的硫氰酸鈉含量經(jīng)《SN/T 3927-2014出口乳制品中硫氰酸鈉含量的測定》[15]中的離子色譜法確定為陰性樣品。加標(biāo)回收實驗中硫氰酸鈉的添加量分別為:1.0、5.0、10.0、20.0和80.0 mg/kg五組,經(jīng)樣品前處理及測定得實驗結(jié)果見表1。由表1可知,本方法的加標(biāo)回收率范圍在83%～99%之間,本方法對高中低各添加濃度均有較好的回收率。

表1 樣品加標(biāo)回收實驗結(jié)果(n=6)Table 1 The results of the adding recovery experiment(n=6)

2.10 精密度檢驗

向全脂滅菌純牛乳陰性樣品中分別添加1.0、5.0、10.0、20.0和80.0 mg/kg的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品,用本研究建立的方法進行20次重復(fù)測定,結(jié)果見表2。從測定平均值分析,表2和表1結(jié)果一致,方法具有較好的加標(biāo)回收率,測定結(jié)果可靠。純牛乳樣品中分別添加1.0、5.0、10.0、20.0和80.0 mg/kg的硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品測定,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.892、5.426、4.899、4.177和1.046,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10.0%,說明該體系精密度良好。

表2 精密度試驗(n=20)Table 2 Precision test(n=20)

3 討論

目前,硫氰酸鈉作為違法添加物已列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》,對其風(fēng)險監(jiān)控具有重要意義。內(nèi)蒙古地區(qū)生鮮乳中硫氰酸鈉含量的風(fēng)險監(jiān)測結(jié)果顯示,2013-2017年生鮮乳中硫氰酸鈉含量平均值為2.75 mg/kg,硫氰酸鈉的平均檢出率為78.14%[18]。故研究者開發(fā)硫氰酸鈉高通量快速方法具有較好的應(yīng)用前景。本研究基于鐵鹽的顯色原理開發(fā)了微孔板顯色定量方法,與現(xiàn)有檢測方法對比如表3。

表3 硫氰酸鈉檢測方法的性能比較Table 3 Comparison of the performance of detection methods for sodium thiocyanate

何瑛等[19]利用分光光度計對乳中的硫氰酸鈉含量進行檢測,其檢測線性范圍為0.25～16.00 mg/kg,相比本研究的線性范圍0.90～80.00 mg/kg,本方法的定量限0.90 mg/kg雖然不及分光度法,但因生鮮乳中硫氰酸鈉含量平均值為2.75 mg/kg[18],此定量限能夠滿足實際的檢測需要。儀器方法如離子色譜法和液相色譜法,為標(biāo)準(zhǔn)確證方法,往往具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性,為硫氰酸鈉檢測的首選方法,特別是離子色譜法[6]。但考慮到現(xiàn)場快速篩查的客觀條件因素,本研究開發(fā)的方法無論在定量限和加標(biāo)回收率方面都能夠滿足實際檢測的需要,特別是本方法基于微孔板顯色比傳統(tǒng)儀器方法和分光光度法具有更高的通量,檢測快速,適合對批量奶樣進行快速篩查。

4 結(jié)論

本研究基于SCN-與Fe3+反應(yīng)生成血紅色絡(luò)合物的原理,經(jīng)系統(tǒng)優(yōu)化選取1.5 mol/L的高氯酸鐵溶液(用2.0 mol/L高氯酸溶液配制)作為最佳顯色劑,室溫25 ℃下反應(yīng)5 min,用酶標(biāo)儀讀取465 nm波長下的吸收值。高氯酸鐵顯色劑與傳統(tǒng)的硝酸鐵顯色劑相比具有更低的本底值(P<0.01)。建立了一種純牛乳中硫氰酸鈉高通量快速檢測的方法,其檢出限為0.27 mg/kg,定量限為0.90 mg/kg,線性范圍為0.90～80.00 mg/kg,加標(biāo)回收率范圍在83.9%～98.6%之間,測試精密度較高,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10.0%。本方法具有準(zhǔn)確度高、通量高、試劑用量小、環(huán)保、快速等優(yōu)點,能夠滿足純牛乳中硫氰酸鈉的檢測,適合于大批量純牛乳中硫氰酸鈉殘留的快速篩查。