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    穴注加貼敷對哮喘大鼠血清IL-10、IL-17和肺組織ICAM-1表達的影響*

    2019-09-23 01:30:12耿立梅閆紅倩于向艷馬璇雯牛曉艷
    關(guān)鍵詞:肺泡支氣管哮喘

    耿立梅,閆紅倩,于向艷,馬璇雯,牛曉艷

    (1. 河北省中醫(yī)院呼吸一科, 石家莊 050011; 2. 石家莊市中醫(yī)院呼吸科,石家莊 050000;3. 鄭州市管城中醫(yī)院內(nèi)科,鄭州 450000)

    哮喘是一種呼吸道慢性炎癥性疾病,具有復雜的發(fā)病機制。研究證實,ICAM-1、IL-10以及IL-17在哮喘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。ICAM-1參與呼吸道炎癥形成的早期階段,可介導白細胞在呼吸道黏膜的黏附和轉(zhuǎn)移;IL-10在炎癥早期可抑制促炎因子、 趨化因子的合成,阻斷炎癥細胞釋放促炎性細胞因子;IL-17是T 細胞誘導的炎癥反應的啟動因素,對炎癥細胞有強大的化學趨化作用。 Treg/Th17細胞及其相關(guān)細胞因子IL-10/IL-17比例失衡是哮喘發(fā)病的重要基礎。中醫(yī)的貼敷及穴注治療哮喘的療效也被研究所證實。本研究旨在探討穴注加貼敷對哮喘大鼠血清IL-10、IL-17和肺組織ICAM-1表達的影響。

    1 材料與方法

    1.1 動物與分組

    雄性Wistar SPF級大鼠60只,體質(zhì)量(120±20) g,由河北醫(yī)科大學實驗室提供。將動物按隨機數(shù)字表法分為正常組(A)、模型組(B)、貼敷組(C)、穴位注射組(D)和貼敷組+穴位注射組(E)各12只。

    1.2 主要試劑和儀器

    雞卵蛋白(Sigma),氫氧化鋁(分析純,成都科龍化工試劑廠),IL-10定量酶檢測試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司), IL-17定量酶分析試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司),免疫組化試劑盒:一抗:兔抗小鼠ICAM-1(北京博安生物科技有限公司),二抗:山羊抗兔 IgG抗體-HRP多聚體(北京中山金橋生物技術(shù)),顯微圖像分析系統(tǒng)HMIAS-2000(武漢同濟醫(yī)科大學),數(shù)碼顯微鏡 DP73(Olympus公司),草分枝桿菌 FU36 注射液1.72 μgml(成都金星健康藥業(yè)有限公司),貼敷(河北省中醫(yī)院呼吸科)。

    1.3 造模方法

    在第1天和第8天給予腹腔注射OVA和氫氧化鋁懸浮液1 mL[1-2],并給予正常組注射相同量的生理鹽水。 在第15天將大鼠置于獨立的密封霧化箱中進行霧化,并用2%OVA溶液進行超聲霧化。 每天1次用生理鹽水替換正常組,每次30 min。 各組大鼠的行為發(fā)生了變化。 在霧化組中,有呼吸短促、咳嗽、煩躁、點頭,甚至四肢柔軟易發(fā),尿失禁和大小便失禁。 挑戰(zhàn)持續(xù)7 d,然后每周2次。

    1.4 實驗方法

    在成功建模后的第22天開始干預。 穴位大椎、雙頂川、雙肺、脾、雙腎服用。 剃須后,食欲組大鼠剃毛, 發(fā)表于6 h; 穴位注射組注射穴位結(jié)核,5組穴位輪流取穴,每穴5 μl; 在應用組中應用穴位,然后應用中藥6 h,模型組用相同的治療組治療。 更換相同量的生理鹽水和空貼紙,每隔1 d操作1次,每次治療3次,共4個療程。

    1.5 標本采集

    在實驗結(jié)束時,將大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml / 100 mg)麻醉,以仰臥位固定,并將動脈血從右側(cè)腹股溝取出至血液收集管。 將管放置30 min,以3000 r/min離心并分配血清,收集放入冷凍管中,在-20℃冷凍備用; 將大鼠的胸腔暴露于胸中線,將右肺中葉置于10%甲醛溶液中固定,在-20℃冷凍備用; 將大鼠的胸腔暴露于胸中線,將右肺中葉置于10%甲醛溶液中固定。

    1.6 指標檢測

    1.6.1 HE染色 右肺中葉常規(guī)石蠟包埋、切片,常規(guī)HE染色。

    1.6.2 ELISA檢測 酶標儀采用HBS-1096C Pro自動酶標儀(上海珂淮儀器有限公司),IL-10和IL-17的ELISA檢測試劑盒分別為北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司上海森雄科技實業(yè)有限公司生產(chǎn)。根據(jù)試劑盒說明書嚴格操作,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-10、IL-17水平。

    1.6.3 免疫組化檢測 嚴格按照SABC免疫組化試劑盒說明操作:切片常規(guī)脫蠟脫水→3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶→滴加一抗(兔抗鼠 ICAM-1,1∶100稀釋)37 ℃孵育4 h→滴加二抗(羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體, 1∶200稀釋) →37 ℃孵育20 min→滴加SABC 37 ℃孵育20 min→DAB顯色,鏡下控制反應時間5 min,蒸餾水終止反應→脫水封片→光鏡下觀察、照相和分析。

    根據(jù)盲法原則,采用日本OLYMPUS公司的AX-70顯微成像系統(tǒng)進行觀察分析及照相,每只大鼠取6張切片,每張切片隨機取2個視野照相。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng),測定ICAM表達的平均光密度值(IOD)。

    1.7 統(tǒng)計學方法

    2 結(jié)果

    2.1 肺組織HE染色

    圖1顯示,氣管周圍及肺組織內(nèi)的中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等炎性細胞HE染色后呈藍色。對照組:細支氣管上皮完整,形態(tài)規(guī)則,支氣管壁不增生,肺泡形態(tài)規(guī)則,肺泡壁規(guī)則;模型組:氣管和肺組織周圍有大量炎性細胞浸潤,支氣管狹窄,上皮細胞分離,黏膜水腫,肺泡腔明顯變小;穴位組:與模型組比較,炎癥細胞浸潤減少,支氣管形態(tài)略微縮小,肺泡形態(tài)不規(guī)則;貼片組:與模型組比較,細支氣管形態(tài)較正常,腔內(nèi)無明顯上皮細胞脫落,壁內(nèi)炎癥細胞,肺泡形態(tài)不完善;穴位注射+貼片組:細支氣管形態(tài)規(guī)則,管周圍可見小炎癥細胞,黏膜正常,肺泡腔形態(tài)較規(guī)則,個別肺泡壁增厚,炎癥細胞增多。

    2.2 各組血清IL-10、IL-17和IgE含量比較

    表1顯示,血清IL-10、IL-17和IgE含量統(tǒng)計學比較顯示,模型組大鼠IL-17、IgE高于正常組,IL-10低于正常組,差異顯著(P<0.05);3個治療組的IL-17和IgE均低于模型組,IL-10高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 IL-17含量:應用組+注射組低于應用組和注射組, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 穴位組與斑塊組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。 IgE含量:貼劑+穴位注射組的應用低于穴位注射組和應用組(P<0.05)。 穴位注射組與放置組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。 IL-10含量:貼劑+穴位組高于貼劑組和空穴注射組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),穴位組與貼劑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

    2.3 各組大鼠肺組織ICAM-1的表達比較

    表1圖2顯示,在正常組支氣管周圍觀察到少量棕黃色陽性細胞, 模型組在支氣管和支氣管分泌物以及間質(zhì)和肺泡棕黃色顆粒周圍具有更多表達。 ICAM-1的平均光密度高于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 應用組和穴位組中的棕黃色顆粒小于模型組。 ICAM-1的表達水平低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 斑塊+穴位組中棕黃色陽性細胞表達不明顯。 與注射組比較,ICAM-1的平均光密度低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 穴位組和貼劑組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

    3 討論

    支氣管哮喘(下稱哮喘)是一種呼吸道慢性炎癥性疾病,其病理生理學機制包括炎癥細胞、炎癥介質(zhì)與呼吸道組織和細胞間的復雜相互作用,導致急性支氣管痙攣,呼吸道壁水腫,黏液分泌增加和呼吸道重構(gòu),從而引起呼吸道阻塞。此外,炎癥還可以引起呼吸道反應性增高。近年來的研究發(fā)現(xiàn),支氣管哮喘的發(fā)病機制主要與免疫反應有關(guān),其中,呼吸道炎癥是哮喘發(fā)病的主要原因之一。本實驗中,模型組血清IL-10含量明顯低于對照組,表明在哮喘的炎癥階段IL-10的含量減低。IL-10是一類強大的免疫抑制因子,主要由CD4+CD25+ Tregs 細胞合成分泌。此外,TH2、TH1淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞也都是其來源[3]。IL-10可抑制促炎因子、趨化因子的合成以及與受體的結(jié)合,并且阻斷炎癥細胞釋放促炎癥細胞因子[4]。缺乏IL-10可能是哮喘的重要原因。 通常認為,Th1 / Th2細胞因子的比例是不平衡的,并且TH2細胞因子的優(yōu)勢是哮喘的免疫學基礎。 最近的研究發(fā)現(xiàn),Treg / Th17細胞及其相關(guān)細胞因子IL-10 / IL-17的失衡也是哮喘發(fā)病機制的重要病理生理基礎[5]。

    表1 各組血清IL-10、IL-17、IgE含量及ICAM-1在肺組織中IOD值表達比較

    注: 與模型組比較:*P<0.05; 與穴注組比較:#P<0.05;與貼敷組、穴注組比較:△P<0.05; 與貼敷組、穴注組比較:▲P<0.05

    圖1 各組大鼠肺組織HE染色比較

    圖2 各組大鼠肺組織ICAM-1表達比較(免疫組化分析)

    本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清IL-17明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計學意義。這與文獻關(guān)于IL-17具有促炎作用的研究相符合,提示IL-17對哮喘炎癥反應的促進作用。有研究顯示,IL-17水平可以作為評估嚴重支氣管哮喘的獨立危險因素[6]。哮喘大鼠氣道的高反應性依賴于TH17細胞應答及中性粒細胞浸潤,表明TH17細胞及其細胞因子IL-17是促進哮喘加重的關(guān)鍵因素[7]。實驗中的模型組大鼠血清IL-17含量明顯高于正常組,而IL-10低于正常組,經(jīng)穴位貼敷組、穴位注射組、穴位注射+貼敷組治療后大鼠的血清IL-17含量較模型組降低,IL-10含量較模型組升高。同時HE染色顯示,血管周圍有少量炎癥細胞,支氣管形態(tài)規(guī)則,黏膜正常,肺泡腔形態(tài)規(guī)則。 上述結(jié)論進一步表明,Treg細胞和TH17細胞之間的失衡是哮喘的重要原因[8],Treg細胞分泌IL-10減少,可導致免疫細胞失衡而發(fā)生哮喘,而IL-10與IL-17的表達失衡,從某種方面也反映了Treg/TH17的失衡狀態(tài)。

    該研究中的另一個指標是細胞間黏附分子-1(ICAM-1),在從血管到炎癥部位的白細胞如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等積累中起關(guān)鍵作用[9]。 ICAM-1主要在白細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞和肺組織中表達。當哮喘發(fā)生時,ICAM-1可以介導和促進上述細胞的黏附[10]。有研究表明,ICAM-1與哮喘的呼吸道炎癥有密切聯(lián)系,使用抗ICAM-1單抗能夠改善哮喘動物模型呼吸道的炎癥細胞浸潤[11]。也有研究推斷[12], ICAM-1能夠協(xié)同炎性因子加快嗜酸粒細胞等炎癥細胞向氣道浸潤,ICAM-1對于氣道炎癥程度的影響很大。模型組大鼠肺組織免疫組化的平均積分光密度(OD)值明顯高于正常對照組,表明在哮喘大鼠的炎癥階段,ICAM-1的表達增強,減少ICAM-1的表達,可以減少氣道炎癥從而控制哮喘。

    傳統(tǒng)醫(yī)學的內(nèi)病外治常配合穴位敷貼來完成。 穴位敷貼對于藥物有放大和增敏作用[13]。貼敷藥物由白芥子、延胡索、甘遂、細辛、百部、五味子、前胡、麻黃組成。上述藥研磨過篩,加用姜汁、香油調(diào)制,選用辛香走竄之品,具有辛溫散寒平喘之功,配以行氣化痰、斂肺平喘藥物,達到祛痰鎮(zhèn)咳平喘的作用。加之對以上穴位的刺激,肺、脾、腎三臟同調(diào),達到宣肺理氣、健脾化痰、培元固本的作用。此外,草分枝桿菌是一種滅活的非病原性細菌[14],能夠促進外周血單個核細胞產(chǎn)生γ-IFN、IL-4,促進TH細胞成熟,上調(diào)TH1細胞功能,從而調(diào)節(jié)Th1 /Th2的平衡,起到防治哮喘的作用[15]。并且能夠提高機體IgG、IgM的水平,從而調(diào)整T細胞亞群的含量,發(fā)揮提高免疫功能的作用[16]。本實驗將草分枝桿菌作為穴位注射藥物注射于哮喘大鼠模型,為草分枝桿菌的應用尋找新的注射方法,也是尋找哮喘防治更有效的手段。穴位敷貼組、穴位注射組、穴位注射+黏連組ICAM-1的表達均低于模型組,表明3種方法均有效。 穴位組和斑塊組之間比較差異無統(tǒng)計學意義,穴位暴露組ICAM-1表達低于其他組。 結(jié)果表明,3種方法均可通過降低肺組織ICAM-1的表達,抑制炎癥細胞的積聚,減輕哮喘的癥狀。 應用效果與穴位注射相似,穴位注射聯(lián)合應用效果更好。

    綜上所述,穴位注射聯(lián)合貼敷可提高哮喘大鼠血清IL-10含量,降低IL-17、IgE水平及ICAM-1的表達。

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