微生物法檢測(cè)嬰幼兒奶粉中游離生物素方法研究

陳靖欣　梁梅娟　蘇佩冰　殷歡

摘要? ? 為了解決微生物法檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中生物素含量常遇到的問(wèn)題，重點(diǎn)關(guān)注了試驗(yàn)過(guò)程中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、培養(yǎng)基和接種液制備的操作細(xì)節(jié)。結(jié)果表明，采用該方法檢測(cè)奶粉中的生物素時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）可達(dá)0.999 8，有較大的提高;平行測(cè)試的RSD為0.75%～2.14%，加標(biāo)試驗(yàn)回收率在96.08%～98.25%之間，平均回收率為97.54%。通過(guò)本方法，優(yōu)化了菌種活化、菌懸液制備及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程，提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞? ? 游離生物素;微生物法;菌懸液;標(biāo)準(zhǔn)曲線

中圖分類號(hào)? ? TS207.3? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）15-0224-02

Research? on? Microbiology? Detection? Method? for? Free? Biotin? in? Infant? Milk? Powder

CHEN Jing-xin? ? LIANG Mei-juan? ? SU Pei-bing? ? YIN Huan

（Food and Drug Inspection Institute of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong 528400）

Abstract? ? In order to solve the problems of microbiological detection for biotin content in infant milk powder，these steps were focused，including the details of standard curve，the preparation of medium and inoculant.Results showed that using this method，the correlation coefficient of the standard curve was 0.999 8，RSD of parallel tests was between 0.75% and 2.14%，and the recovery rate of standard addition experiment was between 96.08% and 98.25%，the average recovery was 97.54%.Through this method，the process of strain activation，suspension preparation and standard solution preparation was optimized，and the detection efficiency and accuracy were improved.

Key words? ? free biotin;microbiological method;bacterium suspension;standard curve

生物素是一種維持人體自然生長(zhǎng)、發(fā)育和正常人體機(jī)能健康的必要營(yíng)養(yǎng)素。目前，測(cè)定嬰幼兒奶粉中生物素的主要方法有高效液相色譜法[1]、微生物法[2-7]、微孔板試劑盒法[8-10]。其中，微生物法實(shí)際操作時(shí)總會(huì)遇到不少問(wèn)題，例如測(cè)試管培養(yǎng)后吸光值不成梯度或測(cè)試菌不生長(zhǎng)，測(cè)試樣濃度不落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，接種液的配制操作復(fù)雜且不知如何防止微生物交叉污染等，再加上菌種活化周期長(zhǎng)、樣品處理復(fù)雜顯著加大了生物素的檢驗(yàn)難度。針對(duì)此類問(wèn)題，本文對(duì)菌種活化、菌懸液制備及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方面進(jìn)行了研究，以期為提升測(cè)定效果提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括生物素標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer）、菌種ATCC 8014植物乳桿菌、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（BD）、乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（BD）和生物素測(cè)定用培養(yǎng)基（BD）。

供試儀器有雙光速紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（安捷倫Cary 60 UV-Vis）、低溫生化培養(yǎng)箱（BINDE KB400）、生物安全柜（美國(guó)BAKER）、鼓風(fēng)干燥箱（BINDE FD115）、高壓滅菌鍋（Hirayama）。

本試驗(yàn)所用玻璃器皿均為此項(xiàng)目專用，不能與其他項(xiàng)目混用。玻璃儀器使用前，至少用酸浸泡12 h，后用純水沖洗，晾干后置于250 ℃干燥箱干熱2 h以上。培養(yǎng)用的試管建議用透氣硅塞，不建議使用螺旋密封蓋。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。準(zhǔn)確稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品101.41 mg定容至1 000 mL，配制成濃度為101.41 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，可存于2～4 ℃條件下12個(gè)月。吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容至100 mL，配制成濃度為1.014 1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，可存于2～4 ℃條件下6個(gè)月。吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液將其稀釋成0.208 2 ng/mL高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.104 1 ng/mL低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用前現(xiàn)配。上述溶液的配制均用50%乙醇溶液作介質(zhì)，容器選用棕色容量瓶。

1.2.2? ? 菌種活化和種子液的制備。①菌種活化對(duì)菌種活性的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將植物乳桿菌直接轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)液中活化，比轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中活化再轉(zhuǎn)種到乳酸桿菌肉湯中的活力要好。因此，將凍存菌株直接接種到乳酸桿菌肉湯中（36±1）℃培養(yǎng)過(guò)夜。再轉(zhuǎn)接一代來(lái)增強(qiáng)活力，獲得足夠濃的乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)液即可開(kāi)始配制接種液。②接種液濃度對(duì)結(jié)果的影響。接種液濃度太低會(huì)造成測(cè)試管耗盡生物素的時(shí)間變長(zhǎng)，而接種液濃度太高又會(huì)造成測(cè)試管生長(zhǎng)量過(guò)大。透光率在60%～80%之間時(shí)，透光率越低，標(biāo)準(zhǔn)系列管擬合值越好。因此，本文將透光率控制在60%～65%之間。③接種液的制備方法及注意事項(xiàng)。接種液若有雜菌污染，會(huì)使所有測(cè)試管菌都生長(zhǎng)，最終沒(méi)有梯度。為了避免污染，提高制備接種液的效率，應(yīng)準(zhǔn)備多支已滅菌的1.5 mL小型離心管，每支分裝1 mL菌液，在2 000 r/min條件下離心2～3 min，傾出上清液，加1 mL已滅菌NaCl溶液，混勻，再離心2～3 min，重復(fù)清洗3～4次，再加入1 mL NaCl混勻。將清洗后的菌液按一定體積添加到10 mL NaCl溶液中，分別為0.1、0.2、0.3 mL……混勻，用分光光度計(jì)以氯化鈉溶液作空白，于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的透光率。需要注意的是，每次測(cè)菌懸液透光率前都需旋渦混勻，保證菌懸液的均勻性、透光率的準(zhǔn)確性。當(dāng)獲得適當(dāng)透光率時(shí)，就按此比例重新配制接種液備用，避免因測(cè)定透光率而受到污染或備用接種液不夠的問(wèn)題。接種液需在接種前1 h內(nèi)制備完成。

1.2.3? ? 樣品處理。樣品處理參照GB 5009.259—2016中6.2.2，根據(jù)樣品中生物素的含量確定稀釋倍數(shù)，確保樣品提取液稀釋后濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

1.2.4? ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。取試管S1～S10分別加入低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液0（未接種空白）、0（接種空白）、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL和高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0、4.0、5.0 mL，補(bǔ)水至5.0 mL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)系列管中生物素含量為0、0、0.101、0.203、0.304、0.406、0.507、0.608、0.811、1.010 ng。加5.0 mL生物素測(cè)定用培養(yǎng)液，每梯度做3個(gè)平行樣。

1.2.5? ? 待測(cè)液的制備。取4支試管，分別加入1.0、2.0、3.0、4.0 mL試樣提取液，補(bǔ)水至5.0 mL，加入5.0 mL生物素測(cè)定用培養(yǎng)液，混勻，每個(gè)梯度做3個(gè)平行。先預(yù)估樣品中維生素含量，可根據(jù)樣品中維生素含量適當(dāng)調(diào)整樣品溶液和水的比例，建議使最低濃度測(cè)試管的濃度盡量落在標(biāo)準(zhǔn)曲線S3～S4的濃度之間。

1.2.6? ? 生物素測(cè)定用培養(yǎng)基的配制及接種。①生物素測(cè)定用培養(yǎng)基的配制。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物素測(cè)定用培養(yǎng)基配制過(guò)程中如果過(guò)度加熱會(huì)造成培養(yǎng)基失效，最終導(dǎo)致所有測(cè)試管的測(cè)試菌均不生長(zhǎng)。因此，生物素測(cè)定用培養(yǎng)基在滅菌前加熱溶解的時(shí)間不能太久，加熱時(shí)需不斷攪拌，加熱至粉末剛?cè)芙馔昙赐Ｖ辜訜?。然后?21 ℃下滅菌5 min，滅菌完畢必須馬上從高壓鍋中取出，并放進(jìn)冰水浴中及時(shí)冷卻，正常的培養(yǎng)基顏色應(yīng)為淺黃色。如果加熱后或滅菌后培養(yǎng)基顏色變深，均不能使用，需重新配制。②接種與培養(yǎng)。用移液槍向上述每個(gè)測(cè)管加入50 μL接種液，其中未接種空白S1和樣品空白除外。將上述所有管一同放入培養(yǎng)箱內(nèi)，在（36±1）℃溫度條件下培養(yǎng)20～24 h，可適當(dāng)延續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，直至生物素消耗盡為止。培養(yǎng)后，S1、S2、S10和樣品空白管均要求不生長(zhǎng)，試驗(yàn)方有效。

1.2.7? ? 待測(cè)液濃度結(jié)果計(jì)算。依據(jù)每個(gè)測(cè)試管的吸光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到相應(yīng)的生物素濃度，再計(jì)算每根測(cè)試管的生物素含量，取4個(gè)試管生物素含量的平均值作為最終結(jié)果。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線

本法測(cè)定生物素的線性范圍為0.101～1.010 ng/100 g，其標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。平行測(cè)試的RSD為0.1%～4.5%。

2.2? ? 方法的重復(fù)性

選取2種嬰幼兒奶粉作試驗(yàn)材料，分別稱取了6個(gè)平行樣進(jìn)行平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢钥闯觯?次平行試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.75%～2.14%之間，說(shuō)明本方法的重復(fù)性良好。

2.3? ? 回收率試驗(yàn)

稱取6份已知生物素含量的1號(hào)樣品作為基質(zhì)，分別添加低、中、高3個(gè)濃度生物素標(biāo)準(zhǔn)品各2組進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯?，該方法回收率在96.08%～98.25%之間，回收效果良好。

3? ? 結(jié)論與討論

從試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果得出，通過(guò)優(yōu)化菌種活化步驟，提高了菌種的活性。該方法重復(fù)性和回收效果良好，同時(shí)，因重點(diǎn)關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和培養(yǎng)基配制過(guò)程中的注意事項(xiàng)，防止了測(cè)試管生長(zhǎng)不好、培養(yǎng)基失效、菌懸液配制時(shí)交叉污染和標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不理想等問(wèn)題，對(duì)微生物法測(cè)定生物素效果也有很大的提高。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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