新疆蟠桃葉附生酵母種群結(jié)構(gòu)分析

劉歡, 張媱, 王翀, 孫燕飛, 雷勇輝

新疆蟠桃葉附生酵母種群結(jié)構(gòu)分析

劉歡1, 張媱1, 王翀3, 孫燕飛1, 雷勇輝2,*

1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,石河子 832003 2. 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,石河子 832003 3. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局,烏魯木齊 830063

通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái), 對(duì)石河子143團(tuán)兩個(gè)蟠桃園所采集的葉片樣本附生酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序, 并分析了其物種的組成、Alpha多樣性以及菌種群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,兩個(gè)桃園中共檢測(cè)到1470個(gè)OTU(Operational Taxonomic Units, 操作分類(lèi)單元), 桃園1中含有個(gè)1217個(gè)OTU, 桃園2中含有609個(gè)OTU, 其中有356個(gè)為共有OTU。共鑒定出酵母菌2門(mén)22屬, 屬于擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、子囊菌門(mén)(Ascomycota), 兩個(gè)桃園共有的酵母屬有線黑粉酵母屬(), 接合酵母屬(), 紅酵母屬(), 隱球酵母屬(),, 畢赤酵母屬(), 假絲酵母屬(),,, 兩個(gè)桃園優(yōu)勢(shì)屬均為線黑粉酵母屬。研究結(jié)果表明石河子地區(qū)蟠桃葉表面附生酵母菌資源豐富, 值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用。

蟠桃葉; 附生酵母; 高通量測(cè)序

0 前言

植物表面棲居有大量的微生物, 但直至上世紀(jì)上半葉, 葉面微生物仍為人們所忽視, 相反, 這段時(shí)間內(nèi)對(duì)土壤微生物的研究眾多[1–2]{Eaton, 1931 #30;Clark, 1949 #32;TIMONIN, 1941 #31;Waksman, 1922 #33}, 在土傳植物病原菌生物防治的研究方法上取得了很大的進(jìn)展, 為植物葉部微生物的研究提供了寶貴的研究方法和經(jīng)驗(yàn)。近年來(lái), 植物葉部微生物的研究逐漸受到重視[3], 對(duì)植物葉片表面的酵母菌的研究也進(jìn)入研究人員的視線。酵母菌擁有豐富的酶系統(tǒng)和蛋白質(zhì), 可以為其他生物體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 可以代謝重金屬或者降解某些難降解的物質(zhì), 維持生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定[4], 葉片作為植物的營(yíng)養(yǎng)器官, 為植物提供有機(jī)物, 進(jìn)行蒸騰作用, 對(duì)植物有著至關(guān)重要的作用。從葉面分離到的許多酵母能夠合成β-吲哚乙酸, 它是一種植物激素, 具有生長(zhǎng)素活性[5], 在植物體內(nèi), 作為執(zhí)行細(xì)胞通訊的化學(xué)信息在代謝、生長(zhǎng)、形態(tài)建成等植物生理活動(dòng)的各個(gè)方面起著十分重要的作用[6]。本世紀(jì)以來(lái), 中外學(xué)者逐漸開(kāi)展了對(duì)不同植物葉片酵母菌的研究。R Zvyagilskaya 等人在以色列耐鹽、耐干旱植物濱藜排鹽的葉片表面分離出幾種好氧、中等耐鹽和耐堿酵母[7]。AM Glushakova 等人研究了25種植物葉片表面附生的酵母菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性動(dòng)態(tài)變化, 指出一般來(lái)說(shuō)植物個(gè)體發(fā)育周期越長(zhǎng), 植物葉片附生酵母的多樣性越高[8]。。董坤等人的研究結(jié)果表明霉菌和酵母菌是普洱茶發(fā)酵制作過(guò)程中主要微生物種類(lèi), 其中, 酵母主要產(chǎn)生酒精和產(chǎn)脂, 對(duì)普洱茶的品質(zhì)、風(fēng)味形成起主要作用[9]。

蟠桃()是李亞科, 桃的變種, 以其形美、色艷、多汁、味美、汁多甘厚、味濃香溢等特點(diǎn)而馳名海內(nèi)外, 新疆是蟠桃的原產(chǎn)地, 石河子一四三團(tuán)的蟠桃屬于蟠桃的極品。一四三團(tuán)從1955年開(kāi)始大面積種植蟠桃, 至今已經(jīng)有60多年蟠桃種植歷史, 該地種植的蟠桃個(gè)大、味甜、汁多, 被譽(yù)為“人間仙果”[10]。目前, 還未有人對(duì)蟠桃桃葉表面附生酵母菌的物種多樣性進(jìn)行研究, 因此, 我們?cè)谝凰娜龍F(tuán)兩個(gè)人工種植蟠桃園采集桃葉樣本, 采用近年來(lái)興起的Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing), 對(duì)葉片表面酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域進(jìn)行測(cè)序, 相較于傳統(tǒng)的分子生物學(xué), 高通量測(cè)序方法具有準(zhǔn)確性高、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)[11], 能客觀并且更全面地反應(yīng)微生物多樣性[12], 可以全面而準(zhǔn)確地分析蟠桃葉片表面酵母菌菌群結(jié)構(gòu), 以了解葉片表面酵母菌菌群的組成特點(diǎn), 為該地區(qū)酵母菌的開(kāi)發(fā)提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 桃葉樣本的采集

采樣時(shí)間及地點(diǎn): 2017年8月, 本研究采樣地點(diǎn)為新疆石河子地區(qū)一四三團(tuán)相距10 km的兩個(gè)不同桃園, 兩個(gè)桃園中樹(shù)齡分布均不一致, 在兩個(gè)桃園中隨機(jī)選取若干長(zhǎng)勢(shì)良好的桃樹(shù), 在選定的桃樹(shù)樹(shù)冠分別采取大小均勻、無(wú)傷病的葉片各約20 g, 混合均勻, 裝入帶有編號(hào)的塑封袋中密封后放入4 ℃冰箱保存。石河子地區(qū)一四三團(tuán), 地處天山北麓, 位于北緯43°26′—45°20′, 東經(jīng)84°58′—86°24′之間, 屬于典型的溫帶大陸性高原氣候, 冬季漫長(zhǎng)嚴(yán)寒, 夏季較短炎熱, 日照充沛, 年日照時(shí)數(shù)為2721—2818 h, 夏季平均溫度在25.1 ℃—26.1 ℃之間、降水量在125.0—207.7 mm之間。

1.2 桃葉基因組DNA提取以及MiSeq測(cè)序

分別將兩個(gè)桃葉樣本與無(wú)菌水按1: 2比例置于錐形瓶中, 搖床6 h后將桃葉在無(wú)菌條件下過(guò)濾, 留下過(guò)濾后的液體用0.45 μm的濾膜進(jìn)行抽濾, 提取抽濾后濾膜上的DNA, 送至上海派森諾生物科技有限公司對(duì)樣品的26S rDNA D1/D2區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序, 使用帶Barcode的26S rDNA特異引物NL-1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL-2 (5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC-3′), 測(cè)序使用Illumina (MiSeq)平臺(tái)。

1.3 生物信息學(xué)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)預(yù)處理, 去除低質(zhì)量reads, 根據(jù)PE數(shù)據(jù)之間的overlap關(guān)系將成對(duì)的reads拼接成一條序列, 去除tags兩端的Barcode序列及引物序列, 去除嵌合體及其短序列等后得到優(yōu)化序列。拼接過(guò)濾后的優(yōu)化序列, 在97%相似度下利用QIIME (v1.8.0)軟件將其聚類(lèi)為用于物種分類(lèi)的OUT (Operational Taxonomic Units), 以對(duì)獲得的序列進(jìn)行OTU歸并劃分, 每個(gè)OTU的代表序列用于分類(lèi)地位鑒定, 統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品每個(gè)OTU中的豐度信息, OTU的豐度初步說(shuō)明了樣品的物種豐富程度。

1.4 Alpha多樣性分析

對(duì)新疆石河子地區(qū)蟠桃葉高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行α多樣性的相關(guān)分析,基于OTU結(jié)果, 計(jì)算Shannon指數(shù), Chao 1指數(shù), 譜系多樣性共3個(gè)指數(shù)來(lái)進(jìn)行生物多樣性分析, 樣本在群落的豐富度和均勻度與指數(shù)值為正相關(guān)關(guān)系[13]。豐富度指數(shù)(Chao 1、ACE)和多樣性指數(shù)(Shannon)的計(jì)算利用Mothur 1.30.1軟件完成。

1.5 物種組成分析

獲得的OTU與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 11.1, http:// rdpcme.msu.edu/)比對(duì), 通過(guò)RDP Classifier鑒定OTU代表性序列的微生物分類(lèi)地位。各組樣品在不同水平的分類(lèi)比較柱形圖是根據(jù)QIIME (v1.8.0)軟件計(jì)算結(jié)果用Origin 9.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU水平分析

利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)2個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序, 經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)前處理, 得到的測(cè)序長(zhǎng)度集中在230—340 bp之間。兩個(gè)樣品共產(chǎn)生4902個(gè)OTU, 原始OTU豐度矩陣中豐度值低于全體樣本測(cè)序總量0.001%(十萬(wàn)分之一)的OTU可能是由于測(cè)序錯(cuò)誤造成的, 將這部分OTU去除, 不加入后期分析, 故兩個(gè)樣品的OTU數(shù)為1470個(gè)。2個(gè)樣品的OTU分類(lèi)結(jié)果(表1)顯示, 桃園1(L1)與桃園2(L2)所測(cè)得的OTU在各個(gè)分類(lèi)水平上均有明顯差異, 桃園1 OTU在各個(gè)分類(lèi)水平上的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于桃園2。通過(guò)Venn圖(圖1)可以顯示桃園1特有OTU 861個(gè), 桃園2特有OTU 253個(gè), 兩個(gè)桃園共有OTU 356個(gè),表明桃園1與桃園2 OTU水平有明顯差異, 桃園1中特有OTU數(shù)目遠(yuǎn)高于桃園2。

2.2 Alpha多樣性分析

在當(dāng)前的測(cè)序量下, 每個(gè)桃葉樣本的Shannon曲線與Chao 1曲線(圖2)都接近平臺(tái)期, 這表明選取的樣本測(cè)序量能夠充分反映待測(cè)樣本真菌菌群結(jié)構(gòu)的合理性及多樣性。

兩個(gè)樣本中真菌Alpha多樣性指數(shù)存在明顯差異(表2), 桃園1中真菌豐富度指數(shù)Chao 1和ACE指數(shù)遠(yuǎn)大于桃園2, 說(shuō)明L1中蟠桃葉附生真菌群落更為豐富。真菌多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)分別為6.28和5.59, L1多樣性指數(shù)高于L2, 說(shuō)明L1中真菌多樣性高, 真菌種類(lèi)較多, 且均勻度較好, 而L2中真菌種類(lèi)較少, 群落多樣性較低, 均勻度稍差, 優(yōu)勢(shì)菌更加明顯。

表1 樣品OTU分類(lèi)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖1 樣品共有OTU維恩圖

Figure 1 The venn diagram of the shared OTU graph of samples

圖2 Shannon指數(shù)(A)和Chao 1指數(shù)(B)曲線分析圖

Figure 2 Shannon index(A) and Chao 1 index(B) curves in the samples of leaves of flat peach

表2 蟠桃葉附生真菌的生物多樣性指數(shù)

2.3 桃葉附生酵母菌種群結(jié)構(gòu)組成分析

獲得的酵母OTU與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 通過(guò)RDP Classifier鑒定, 可以獲得樣本中酵母菌在各分類(lèi)水平的具體組成(表3)。類(lèi)群數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明, 兩個(gè)桃園桃葉附生酵母在門(mén)綱目科屬水平上數(shù)目相差不大, 但在種水平上, 桃葉1與桃葉2附生酵母菌分別有72和51種, 桃葉1酵母菌類(lèi)群數(shù)相對(duì)豐度高于桃葉2。

兩個(gè)桃葉樣本表面附生的酵母菌菌群組成既有共性, 又存在一定差異(圖3)。圖3A為兩個(gè)樣本在門(mén)分類(lèi)水平上的組成結(jié)果, 桃葉1中的擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)占酵母菌菌群57.6%, 子囊菌門(mén)(Ascomycota)占酵母菌菌群42.4%, 而桃葉2中的擔(dān)子菌門(mén)占酵母菌菌群52.5%, 子囊菌門(mén)占酵母菌菌群47.5%。在屬分類(lèi)水平上(圖3B), 桃葉1和桃葉2分別包含有15個(gè)和16個(gè)酵母屬, 但屬的種類(lèi)有差異, 兩個(gè)桃園共包含22個(gè)屬。其中兩個(gè)桃園共有的屬有9個(gè), 為線黑粉酵母屬(), 接合酵母屬(s), 紅酵母屬(), 隱球酵母屬,, 畢赤酵母屬(), 假絲酵母屬(),,, 他們?cè)谔覉@1和桃園2中所占比例分別為76.65%和90.06%, 8.38%和0.28%, 7.98%和0.83%, 2.80%和1.38%, 1.20% 和0.55%, 1.00%和0.83%, 0.20%和1.10%, 0.20%和0.83%, 0.20%和0.55%。兩個(gè)桃園樣本均以線黑粉酵母屬() 為優(yōu)勢(shì)屬, 圖3B中顯示桃園1相比桃園2酵母屬的分布更加均勻, 桃園2線黑粉酵母屬優(yōu)勢(shì)更加明顯。

桃園1中有6個(gè)特有屬: 棍孢屬() 0.40%, 梗孢酵母屬()0.20%, 三角酵母屬()0.20%,0.20%, 兔糞酵母屬()0.20%, 海洋嗜殺酵母() 0.20%; L2中有7個(gè)特有屬:1.10%,0.55%, 擲孢酵母屬() 0.55%, 裂殖酵母屬()0.55%, 雙足囊菌屬()0.28%,0.28%, 梅奇酵母屬()0.28%(圖3B)。由此可見(jiàn), 兩個(gè)桃園中特有的種屬種群數(shù)量都不是很高。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基于Illumina MeSeq平臺(tái), 采用26S rDNA D1/D2區(qū)域序列高通量測(cè)序, 首次對(duì)石河子一四三團(tuán)兩個(gè)蟠桃園內(nèi)桃葉表面酵母菌群進(jìn)行了分析, 探索了蟠桃桃葉表面酵母菌的種群結(jié)構(gòu)及多樣性。引物NL1和NL4是酵母菌測(cè)序的通用引物, 但對(duì)于高通量測(cè)序而言片段過(guò)大, 故本研究采用引物NL1和NL2, 通過(guò)該引物測(cè)序, 兩個(gè)桃葉樣本獲得了酵母菌共2門(mén)22屬, 在門(mén)分類(lèi)水平上, 兩個(gè)樣本都集中在擔(dān)子菌門(mén)和子囊菌門(mén), 在屬分類(lèi)水平上, 桃葉1和桃葉2分別包含有15個(gè)和16個(gè)酵母屬, 結(jié)果表明該引物對(duì)酵母菌有一定的特異性, 但除了酵母菌外, 還檢測(cè)到其他非酵母真菌, 如小球腔菌屬()、分子孢子菌屬()和曲霉屬()等, 因此本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析時(shí)候要剔除非酵母菌物種。林建春等人使用高通量測(cè)序方法研究清香型白酒發(fā)酵中酵母種群結(jié)構(gòu)時(shí), 先提取酒醅宏基因組, 之后對(duì)細(xì)菌、酵母和霉菌進(jìn)行熒光定量, 高通量測(cè)序時(shí)所用的引物為真菌的ITS2區(qū)域的ITS3(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[14], 關(guān)于酵母菌高通量測(cè)序特異性引物的選擇需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。此外, 在種的分類(lèi)水平上, 兩個(gè)桃葉1與桃葉2分別獲得了72和51個(gè)酵母種, 結(jié)合所分離的可培養(yǎng)酵母菌種類(lèi)(未發(fā)表)來(lái)看, 石河子地區(qū)蟠桃桃葉附生酵母菌種群數(shù)量十分可觀, 還有很多酵母菌資源值得我們進(jìn)一步分離、開(kāi)發(fā)。

表3 各分類(lèi)水平的酵母菌類(lèi)群數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖3 門(mén)分類(lèi)水平(A)和屬分類(lèi)水平(B)豐度分布柱狀圖

Figure 3 Histogram of fractional abundance in phylum and genus classification levels

此次兩個(gè)采樣地點(diǎn)距離較近, 所處生態(tài)環(huán)境相似, 而測(cè)序結(jié)果兩個(gè)桃園樣本酵母菌種群結(jié)構(gòu)雖有一致性, 但也存在差異, 均發(fā)現(xiàn)了特有的酵母屬, 可能是由于酵母菌所處的微環(huán)境不同, 推測(cè)其具體原因主要為桃園管理方式的不同, 桃園1管理良好, 桃樹(shù)長(zhǎng)勢(shì)很好; 桃園2中雜草叢生, 田管處理不是很好, 桃園1與桃園2相比環(huán)境更加穩(wěn)定, 外界干擾較小, 故桃園1酵母菌種群相對(duì)呈現(xiàn)出更強(qiáng)的均勻性, 此外, 施肥、澆水、土壤等天然條件也可能是導(dǎo)致酵母菌種類(lèi)不同的原因。從高通量測(cè)序結(jié)果來(lái)看, 兩個(gè)桃園樣本中所占比例較大的酵母屬有線黑粉酵母屬, 接合酵母屬, 紅酵母屬, 隱球酵母屬。線黑粉酵母屬主要位于植物體內(nèi)及表面, 高原湖泊也有分布, 有研究表明黑粉酵母菌可以產(chǎn)生α-淀粉酶等多種胞外酶[15], 目前對(duì)于微生物胞外酶的研究已經(jīng)取得了明顯的成就, 微生物由于其多樣性、可再生性和對(duì)遺傳操縱的敏感性, 顯示出巨大的產(chǎn)酶潛力[16], 進(jìn)一步研究有助于疾病控制, 社會(huì)生態(tài)環(huán)境平衡[17], 具有廣泛應(yīng)用前景。研究報(bào)道發(fā)酵性接合酵母有較強(qiáng)的富硒能力, 生產(chǎn)中可將富硒酵母制成飼料補(bǔ)充動(dòng)物體內(nèi)硒的含量, 降低死亡率, 改善繁殖性能等[18]。紅酵母屬酵母菌是世界各大洋和中國(guó)海的優(yōu)勢(shì)菌[19], 在空氣中經(jīng)常出現(xiàn), 海藻、樹(shù)葉、木片等基物中也有分布。紅酵母菌發(fā)酵可以生產(chǎn)天然的β-胡蘿卜素[20], 可以有效保護(hù)細(xì)胞內(nèi)生物大分子不受自由基的損傷、維持正常生命代謝、防治衰老和癌癥, 利用紅酵母提取色素簡(jiǎn)單方便, 成本低廉[21], 具有很大的實(shí)用價(jià)值。隱球酵母菌可以從水果, 果蠅的腸道, 樹(shù)皮和與樹(shù)結(jié)合的苔鮮和地衣中分離到。相光明等人對(duì)隱球酵母菌高效產(chǎn)脂發(fā)酵條件進(jìn)行了研究[22], 微生物產(chǎn)脂具有油脂含量高、生產(chǎn)成本低、可連續(xù)生產(chǎn)、周期短、不受季節(jié)和氣候影響的優(yōu)點(diǎn), 產(chǎn)品可用于制取生物柴油、類(lèi)可可脂及高檔食用調(diào)和油等[23], 高值化潛力大, 具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景, 可以由此開(kāi)辟新的油脂資源。因此, 本研究對(duì)桃園酵母菌資源進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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Community structure analysis of yeast attached to flat peach leaves in Xinjiang

LIU Huan1, ZHANG Yao1, WANG Chong3, SUN Yanfei1, LEI Yonghui2,*

1. College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, China 2. Agricultural college of Shihezi University, Shihezi 832003, China 3. Xinjiang Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau, Urumqi 830063, China

To study the structural diversity of the epiphytic yeasts isolated from leaves of flat peach in Shihezi, we used 26S rDNA Illumina Miseq high-throughput sequencing method to analyze the composition of species, the Alpha diversity and the composition of yeast community structure of epiphytic yeasts which were isolated from the fresh leaves of tow flat peach orchards in Shihezi.The result showed that a total of 1470 OTU(Operational Taxonomic Units) were detected through 26S rDNA high-throughput sequencing. There were 1217 OTU in orchard 1 and 609 OTU in orchard 2, among which 356 OTU were shared. All yeasts were classified into 2 plylums and 22 genus in the two samples by identification. Basidiomycota and Ascomycetes were the dominant plylums of both tow flat peach orchards. The shared genus of tow samples were,,,,,,,and. The dominant genu of two samples wasIn conclusion, we know that there are abundant yeast resources on the surface of flat peach leaves in Shihezi area, and it is worthy of further study for exploitation and utilization.

flat peach leaf; epiphytic yeast; high-throughput sequencing

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.04.005

Q938.1

A

1008-8873(2019)04-029-06

2018-06-07;

2018-08-28基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31860003)

劉歡(1998—), 女, 山西運(yùn)城人, 主要從事微生物資源研究, E-mail: 1042441810@qq.com

雷勇輝(1978—), 男, 碩士, 主要從事生物學(xué)研究, E-mail: 497976@qq.com

劉歡, 張媱, 王翀, 等. 新疆蟠桃葉附生酵母種群結(jié)構(gòu)分析[J]. 生態(tài)科學(xué), 2019, 38(4): 29-34.

LIU Huan, ZHANG Yao, WANG Chong, et al. Community structure analysis of yeast attached to flat peach leaves in Xinjiang[J]. Ecological Science, 2019, 38(4): 29-34.