一株雞毒支原體的致病性研究與藥敏試驗(yàn)

高奎鵬 孫培明

一株雞毒支原體的致病性研究與藥敏試驗(yàn)

高奎鵬 孫培明*

（臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院 山東 臨沂 276000）

為了對1株從雞場分離到雞毒支原體進(jìn)行致病性的研究以及敏感藥物的篩選。試驗(yàn)對20枚孵化5日齡的SPF雞胚進(jìn)行了兩種不同濃度毒株的攻毒試驗(yàn)，觀察雞胚的死亡及剖檢情況，并將死亡雞胚卵黃壁上的支原體回收，進(jìn)行9種常用藥物的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明：接種不同濃度均出現(xiàn)死胚，高濃度組雞胚死亡率高達(dá)100%，而低濃度組的雞胚死亡率為70%，剖檢氣囊有纖維素滲出，氣管、支氣管栓塞現(xiàn)象；藥敏試驗(yàn)表明：兩種毒株已對恩諾沙星和大觀霉素等藥物敏感性降低，而對泰妙菌素和妙達(dá)安兩種藥物敏感性較高。說明毒株的致病力較強(qiáng)，對子代造成了孵化率降低、弱雛并伴呼吸道病變的影響，但敏感藥物對其具有明顯的抑制作用。

雞毒支原體 致病性 雞胚卵黃囊接種 剖檢 藥敏試驗(yàn)

雞毒支原體(MG)感染又稱雞敗血支原體感染，由于其病程長，是雞呼吸道病的一種，又稱之為慢性呼吸道病(CRD)，在雞主要表現(xiàn)為慢性呼吸道癥狀、氣囊炎等。其特征是咳嗽、流鼻液，呼吸時(shí)有啰音。本病是危害肉仔雞生產(chǎn)的主要疾病[1]。隨著養(yǎng)雞規(guī)模加大、飼養(yǎng)方式改變和飼養(yǎng)密度提高，該病發(fā)病率越來越高，主要影響雛雞生長、使成年雞產(chǎn)蛋減少，造成養(yǎng)雞業(yè)經(jīng)濟(jì)上的重大損失，危害性日益突出[2-3]，本文對已分離到的兩種毒株進(jìn)行了致病性的研究及對支原體藥物敏感性的試驗(yàn)，證實(shí)了毒株濃度對致病性的影響，并為臨床防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)毒株 LJ，由山東省濟(jì)南市某種雞場病雞體內(nèi)，通過Fery培養(yǎng)液分離培養(yǎng)得到，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為雞毒支原體。

1.1.2 試驗(yàn)雞胚 SPF雞胚，由濟(jì)南濟(jì)南賽斯家禽科技有限公司提供。SPF雞胚與全自動(dòng)孵化箱用0.1%新潔爾滅消毒后，放入20枚胚體大小相等的健康雞胚，孵化5d備用。

1.1.3 試驗(yàn)藥品 取養(yǎng)殖場常用于治療雞毒支原體的藥物替米考星(批號K0311805，含量89%)、泰妙菌素(批號110803008，含量99%)、妙達(dá)安(主要成分80%延胡索酸泰妙菌素，批號163085181，含量45%)、林可霉素(批號9912001，含量85%)、氟苯尼考(批號160252108，含量97%)、強(qiáng)力霉素(批號170407，含量98%)、恩諾沙星(批號100571296，含量99%)、左氧氟沙星(批號220832126，含量98%)和大觀霉素(批號010272602，含量779u/mg)9種藥物，均購自青島華盛獸藥股份有限公司

1.1.4 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(型號101-3B，上海景邁儀器設(shè)備有限公司)；全自動(dòng)孵化機(jī)(型號FHJ001，上海景邁儀器設(shè)備有限公司)

1.2 方法

1.2.1 支原體攻毒試驗(yàn) 本次試驗(yàn)為研究支原體的致病性，將試驗(yàn)按菌液濃度不同分為兩大組A組和B組(表1)。A組10枚雞胚，分為2組，每組5枚雞胚，1組為試驗(yàn)組，卵黃囊接種[4]支原體菌液0.3ml，2組為對照組。B組10枚雞胚，分為2組，每組5枚雞胚，I組為試驗(yàn)組，卵黃囊接種用Fery培養(yǎng)液1:1000稀釋的菌液，每枚0.3ml，II組為對照組。

表1 雞胚分組情況

1.2.2 孵化 為防止相互干擾，將A組與B組接種后的雞胚分別放在兩個(gè)全自動(dòng)孵化機(jī)內(nèi)進(jìn)行孵化，每日照蛋、觀察死亡情況。

1.2.3 雞毒支原體的回收 將孵化過程中死亡的雞胚取卵黃壁，卵黃，氣囊，氣管、支氣管分泌物浸泡于Fery液體培養(yǎng)液中，用無菌的組織剪剪碎卵黃壁、氣囊、氣管和支氣管，浸泡20min后，用0.45μm的細(xì)菌濾器過濾于無菌的西林瓶中，放入恒溫培養(yǎng)箱，待培養(yǎng)液變黃后，以雞毒支原體與Fery液體培養(yǎng)液1:9的劑量傳代至穩(wěn)定備用[5-6]。

1.2.4 藥品的處理 參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥品濃度稀釋，稀釋后用0.22微米細(xì)菌濾器分別過濾藥液備用。替米考星(含量89%)原粉0.2876g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，?nèi)含1280μg/ml。泰妙菌素(含量99%)原粉0.2586g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，?nèi)含1280μg/ml。妙達(dá)安(含量45%)原粉0.5689g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，?nèi)含1280μg/ml。林可霉素(含量85%)原粉0.3012g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，?nèi)含1280μg/ml。氟苯尼考(含量97%)原粉0.2639g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆茫瑑?nèi)含1280μg/ml。強(qiáng)力霉素(含量98%)原粉0.2612g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，?nèi)含1280μg/ml。恩諾沙星(含量99%)原粉0.2585g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆?，?nèi)含1280μg/ml。左氧氟沙星(含量98%)原粉0.2612g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆茫瑑?nèi)含1280μg/ml。大觀霉素(含量779u/mg)原粉0.3286g溶于200ml水中，-20℃保存?zhèn)溆茫瑑?nèi)含1280μg/ml。

1.2.5 最低抑菌濃度測定 （1）顏色變化單位(CCU)的測定：取15支試管，每個(gè)試管先加入1ml Fery培養(yǎng)液，再向每組第1管內(nèi)加入0.2ml菌液，按10倍倍比稀釋至第14孔，第15孔做空白對照；重復(fù)3次，蓋上試管塞，防治污染，37℃培養(yǎng)，每日觀察結(jié)果，記錄試管顏色變化，當(dāng)變色試管不再增加后確定終點(diǎn)。將導(dǎo)致顏色改變的菌液最高稀釋度看做為1CCU/ml[7]。（2）最低抑菌濃度(MIC)測定：將試驗(yàn)以藥品名稱分為9組，每組14支試管，無菌操作每個(gè)試管先加入1ml Fery培養(yǎng)液，再取0.4ml配置好的藥液加入第一支試管，充分混勻后取出0.4ml至第二管，以此類推，等比稀釋至第13管，第13管吸出0.4ml棄去，第14管為對照；再向每組1~13管中各加入回收后生長穩(wěn)定的雞毒支原體菌液5000CCU/ml。將試管放入培養(yǎng)箱，每日觀察結(jié)果，記錄試管顏色變化，當(dāng)變色試管不再增加后確定終點(diǎn)。以抑制雞毒支原體生長的抗生素的最高稀釋度作為最低抑菌濃度[7]。

3 結(jié)果與分析

3.1 攻毒試驗(yàn)雞胚的死亡情況

雞胚攻毒試驗(yàn)后每天對雞胚進(jìn)行照蛋檢查，并記錄雞胚的死亡情況見表2。

表2 雞胚死亡總數(shù)

由表2可見：LJ組接種原液的雞胚在接種7d后開始死亡，16d后(第21天)，死亡率100%；而接種1:1000倍稀釋過的菌液雞胚10d后開始死亡，16d后(第21天)，死亡率70%。

3.2 雞胚的孵出和生長情況

（1）A組孵化21d后，試驗(yàn)組無雞胚孵化成功；對照組孵出10只。（2）B組孵化21d后，試驗(yàn)澤孵出3只；對照組10只。

3.3 雞胚的剖檢情況

A組與B組雞胚的在剖檢過程中，未孵出雞胚出現(xiàn)氣管、支氣管內(nèi)有白色栓塞物，孵出弱雛死后剖檢發(fā)現(xiàn)接種支原體的雞胚其支氣管和氣囊均有纖維素滲出，根據(jù)H.W.Yoder將氣嚢病理損傷判斷，A組較為明顯，均為3級；B組均為2級；對照組致死剖檢均為0級。氣嚢病理損傷計(jì)分結(jié)果參考：H.W.Yoder將氣嚢病理損傷分為5級：（1）O級：氣嚢正常，薄而透明；（2）1級：氣嚢僅有稍增厚的灰色區(qū)或黃色滲出斑點(diǎn)；（3）2級：部分氣嚢易見到灰至黃色滲出，有時(shí)出現(xiàn)泡沫，氣嚢增厚；（4）3級；大部分氣嚢增厚，布滿大量黃白色干酪物；（5）4級：幾乎整個(gè)氣嚢布滿黃白色干酪樣滲出物，氣嚢嚴(yán)重增厚[8-9]。

3.4 顏色變化單位(CCU)的測定結(jié)果

試管放入恒溫培養(yǎng)箱7d后，變色試管不再增加，終點(diǎn)稀釋濃度LJ為10-7，顏色變化單位為107CCU/ml。

3.5 最低抑菌濃度測定結(jié)果

試管放入恒溫培養(yǎng)箱10d后，以抑制雞毒支原體生長的抗生素的最高稀釋度作為最低抑菌濃度，結(jié)果見表3。

表3 各種藥物對毒株的顏色變化單位 (CCU/ml)

由于Fery培養(yǎng)液配制時(shí)因?yàn)榧尤肓朔蛹t而表現(xiàn)粉紅色，若有支原體生長，則支原體利用培養(yǎng)液中的營養(yǎng)而產(chǎn)生一些酸性產(chǎn)物，液體的顏色則會由粉紅色變成黃色，以此來判斷培養(yǎng)液中是否有支原體生長。由表3可見：對于雞毒支原體LJ來說，泰妙菌素與妙達(dá)安兩種藥物的MIC為最大，敏感性較高，而對恩諾沙星，大觀霉素等藥物敏感性降低。

4 討論

（1）支原體疾病嚴(yán)重影響著雞胚的孵化率，降低雛雞的生長速度，使成年雞產(chǎn)蛋率下降等不良影響，雞支原體病發(fā)病慢，病程長，可與其他病原混合感染或繼發(fā)感染，如大腸桿菌、新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性鼻炎等混合感染，很難根除，給養(yǎng)殖戶帶來很大經(jīng)濟(jì)損失[10]。（2）本試驗(yàn)采用養(yǎng)殖場分離到的支原體毒株LJ，經(jīng)過SPF雞胚的卵黃囊接種試驗(yàn)，根據(jù)雞胚接種支原體的菌液濃度的不同，發(fā)現(xiàn)兩組均出現(xiàn)死胚，高濃度組雞胚死亡率高達(dá)100%，而低濃度組的雞胚死亡率為70%，剖檢發(fā)現(xiàn)氣囊有纖維素滲出，氣管、支氣管栓塞現(xiàn)象，以接種雞胚分別與對照組的雞胚死亡情況和剖檢情況可以做出分析，LJ致病力較強(qiáng)，對雞胚的孵化率有很大影響，卵黃囊內(nèi)的支原體可直接造成雛雞的呼吸系統(tǒng)病變，尤其是在出殼前的1~2d，而且濃度越高，雞胚死亡速率越高，病變越明顯。（3）長期以來，防制雞毒支原體感染時(shí)，人們常常使用不同的抗生素，其中應(yīng)用最為廣泛的藥物是泰樂菌素、紅霉素、喹諾酮類和氨基糖苷類等抗菌素，但由于疫苗的使用、抗生素的濫用等情況，防治效果已不確定。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，該株支原體對替米考星，林可霉素，恩諾沙星，左氧氟沙星，大觀霉素敏感度已降低，對泰妙菌素，妙達(dá)安表現(xiàn)敏感較高，可做臨床用藥的借鑒依據(jù)。盡管體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對部分藥物敏感，但臨床使用時(shí)不僅需要疫苗防疫和藥物治療，更需要包括加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全等綜合措施。

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（2019–06–05）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-11-17)

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