基于DArTseq的SNP標(biāo)記的西瓜核心 種質(zhì)遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

羊杏平 任潤(rùn)生 徐錦華 李蘋(píng)芳 張曼 劉 廣 姚協(xié)豐

目的與意義： 親本材料是進(jìn)行育種工作的基礎(chǔ)，遺傳基礎(chǔ)狹窄導(dǎo)致難以培育出突破性品種，因此亟需加強(qiáng)遺傳資源的引進(jìn)及其農(nóng)藝性狀特征和遺傳基礎(chǔ)的了解與掌握，對(duì)現(xiàn)有優(yōu)良西瓜品種和育種親本材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，可有效減少相似遺傳背景的組合，減少育種的工作量。同時(shí)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記種類及檢測(cè)手段日趨完善，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行聚類分析，可以快速了解植物的遺傳多樣性、親緣關(guān)系和品種鑒定等。本研究對(duì)37份核心西瓜種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，確定這些西瓜核心種質(zhì)材料間的遺傳背景差異，為后期育種工作中的親本組配、等位基因發(fā)掘和標(biāo)記輔助選擇等提供參考。

材料與方法： （1）所用的西瓜核心種質(zhì)材料共37份，主要包括優(yōu)良國(guó)內(nèi)西瓜品種和國(guó)外引進(jìn)品種、高代育種自交系、以及野生西瓜種質(zhì)材料。這些材料由于來(lái)源不同，存在一定的遺傳差異，各種表型性狀差異明顯。（2）溫室內(nèi)取幼嫩葉片，抽真空干燥保存，采用CTAB法提取基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，稀釋至50～100 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?）采用DArT標(biāo)記結(jié)合第二代短序列測(cè)序技術(shù)獲得相應(yīng)材料的SNP基因型。（4）利用軟件PowerMarker Version 3.25計(jì)算主基于位點(diǎn)頻率（major allele frequency），基因多樣性（gene diversity），多態(tài)性信息含量（polymorphic information content）等。利用軟件Darwin Version 5.0，采用基于遺傳相似系數(shù)（genetic similarity，GS），并以非加權(quán)數(shù)據(jù)分析法（Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average，UPGMA）進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹(shù)狀圖。軟件Darwin Version 5.0也用來(lái)進(jìn)行主成分分析。（5）以Structure v2.3軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析，該方法利用每個(gè)個(gè)體多位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)（multilocus genotype）的差異進(jìn)行聚類，對(duì)個(gè)體的來(lái)源進(jìn)行推斷，并估計(jì)最佳群體組群數(shù)K，其取值范圍為1～8，將馬爾可夫鏈（Markov Chain Monie Carlo，MCMC）開(kāi)始時(shí)的不作數(shù)迭代（length of burn-in period）設(shè)為 10 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為10 000次，迭代次數(shù)（number of iterations）設(shè)置為8。

結(jié)果與分析： （1）本實(shí)驗(yàn)采用DArT標(biāo)記結(jié)合第二代測(cè)序方法對(duì)37份西瓜核心種質(zhì)進(jìn)行基因型分析，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果采用重復(fù)率為99.7%和call rate 為98.8%的標(biāo)準(zhǔn)，共獲得了4 808個(gè)在37個(gè)西瓜核心種質(zhì)間具有多態(tài)性的SNP標(biāo)記。為了使后續(xù)分析結(jié)果更加可靠，對(duì)4 808個(gè)SNP標(biāo)記在37個(gè)西瓜核心種質(zhì)中的缺失率大于5%的標(biāo)記剔除，最后共獲得了3 882個(gè)SNP標(biāo)記用于后續(xù)進(jìn)一步的分析。同時(shí)以西瓜品種‘97103的基因組序列為參考基因組序列對(duì)每一個(gè)SNP在染色體上的物理位置進(jìn)行了確定（最小堿基相似度為大于90%，E值為小于10-5），平均每條染色體上含有352個(gè)SNP標(biāo)記。②根據(jù)對(duì)37份西瓜核心種質(zhì)SNP基因型分析，基因多態(tài)性（gene diversity）的范圍為0.03～0.5;標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（PIC ：polymorphism information content）值為0.02～0.38。平均基因多態(tài)性和PIC值分別為0.14和0.13。對(duì)兩者值的分析，共有91%的基因多態(tài)性值和93%的多態(tài)性信息含量（PIC）值位于0.05～0.20之間。（3）根據(jù)3 882個(gè)SNP標(biāo)記計(jì)算得到遺傳相似系數(shù)，按Neighbor-joining （N-J）法構(gòu)建了37份西瓜核心種質(zhì)材料之間的遺傳關(guān)系聚類圖，其中2個(gè)西瓜野生種質(zhì)明顯地和其他35分西瓜栽培種分開(kāi)。為了使聚類圖顯示的效果更加清晰，進(jìn)一步對(duì)35個(gè)栽培西瓜種質(zhì)又進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果顯示35個(gè)栽培西瓜種質(zhì)可以被區(qū)分為3類。第一類包括了11份材料：Au-RS，Au-GSC，All Sweet，Smokylee，Charleston Gray，Sugarlee，LW023，SSD，Crimson Sweet，9 Jiu， LW022。第二類包含了20份材料：Calhoun Gray，P4，P1-3，P3-1，Sugar baby，Hong 5-2，SW055-1，MW097，MW099，K3，F(xiàn)uxing F8，MW095，MW096，SW057，Red Flesh 8424，F(xiàn)urong F8，MW026，MW089，J2，MW022，其中2份來(lái)自美國(guó)，1份來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣，剩余為來(lái)自中國(guó)大陸。第三類包含4份材料，R-1-3，R-1-2，R-2-1-2，SW043，其中3份為江蘇省選育的育種系，1份來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣的育種系。（4）為了更加直觀地觀察到各個(gè)西瓜種質(zhì)材料之間的關(guān)系，我們根據(jù)遺傳相似系數(shù)進(jìn)行了主成分分析。結(jié)果顯示37個(gè)西瓜核心種質(zhì)也是被明顯地分為2大類，即野生西瓜類和栽培西瓜類。同樣，和聚類結(jié)果一樣的是，剩下的35份西瓜栽培品種也主要分為3類，第一主成分和第二主成分分別介紹變異的25.9%和11.2%。（5）同樣用3 882個(gè)SNP標(biāo)記分別對(duì)37份和35份西瓜種質(zhì)進(jìn)行了群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。對(duì)37份西瓜種質(zhì)來(lái)說(shuō)，LnP（D）和ΔK的峰值都出現(xiàn)在當(dāng)K值等于2時(shí)，說(shuō)明這37份西瓜種質(zhì)也主要?jiǎng)澐譃橐吧惡驮耘囝?個(gè)大類。當(dāng)對(duì)35個(gè)西瓜種質(zhì)材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析時(shí)，LnP（D）值隨著K值從1到8連續(xù)遞增時(shí)，LnP（D）值的拐點(diǎn)出現(xiàn)在當(dāng)K值從2到3時(shí)。同樣ΔK值的峰值出現(xiàn)在當(dāng)K值等于3的時(shí)候。這些結(jié)果說(shuō)明35份西瓜種質(zhì)主要被分為3個(gè)類群，結(jié)果和聚類分析和主成分分析的結(jié)果完全一致。

結(jié)? ? ?論： 為了將一些核心西瓜種質(zhì)材料有效地在西瓜育種中加以利用，本研究利用3 882個(gè)SNP標(biāo)記，對(duì)37個(gè)西瓜核心種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示2個(gè)野生西瓜種明顯區(qū)別于西瓜栽培種，而剩下的35個(gè)西瓜栽培種則主要?jiǎng)澐譃?個(gè)主要的類群。