基于全基因組重測序構(gòu)建西瓜高密度遺傳 圖譜和果實(shí)相關(guān)性狀的基因定位

李兵兵 路緒強(qiáng) 豆峻嶺 高磊 趙勝杰 何楠 劉文革

目的與意義：遺傳圖譜是進(jìn)行重要農(nóng)藝性狀QTL/基因定位、圖位克隆、分子標(biāo)記輔助育種等工作的重要工具。長期的人工選擇使得栽培種西瓜的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)一步狹窄，使得高效可獲得的分子標(biāo)記成為限制西瓜高密度遺傳圖譜構(gòu)建的重要因素。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和西瓜參考基因組草圖的組裝完成，通過測序獲得大量分子標(biāo)記以構(gòu)建高密遺傳圖譜成為可能。通過全基因重測序構(gòu)建高密度遺傳圖譜，可以更快更準(zhǔn)確的檢測重組斷點(diǎn)，開發(fā)大量適于遺傳圖譜構(gòu)建的分子標(biāo)記。最近幾年，陸續(xù)有多張西瓜遺傳圖譜發(fā)表。但這些圖譜大都基于簡化基因組測序，遺傳圖譜的飽和度相對不足;作圖群體多為臨時(shí)性分離群體，不能進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，影響后續(xù)基因定位工作的準(zhǔn)確性。筆者構(gòu)建了重組自交系作為永久性作圖群體，通過對其進(jìn)行全基因組重測序構(gòu)建了一張西瓜高密度遺傳圖譜，并對果皮顏色、種皮顏色和果實(shí)苦味3個(gè)性狀進(jìn)行了初定位，以期用于西瓜分子遺傳育種等工作。

材料與方法：以具有顯著性狀差異的自交系材料‘9904和‘Handel為親本，經(jīng)過連續(xù)7代自交，構(gòu)建了含126個(gè)單株的重組自交系。‘9904具有墨綠色果皮、淺黃色種皮、苦味果實(shí); ‘Handel具有淺綠色果皮、黑色種皮、無苦味果實(shí)。采集西瓜植株幼嫩葉片，提取植物基因組DNA，質(zhì)量檢測合格的DNA將用于測序建庫。高質(zhì)量的DNA被隨機(jī)打斷為200～500 bp的片段，然后經(jīng)過DNA片段末端修復(fù)、3端加A、添加測序接頭和進(jìn)行純化、最后經(jīng)PCR擴(kuò)增等完成測序文庫的構(gòu)建。文庫經(jīng)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測后通過Illumina HiSeqTM測序平臺(tái)進(jìn)行測序。完成標(biāo)記的填補(bǔ)和校正后，根據(jù)子代重組情況進(jìn)行bin劃分。將各樣本按照染色體物理位置排列整齊，當(dāng)任何樣本出現(xiàn)分型轉(zhuǎn)變時(shí)認(rèn)為出現(xiàn)重組斷點(diǎn)，然后將重組斷點(diǎn)間的SNP化為一個(gè)bin中。同時(shí)對bin進(jìn)行偏分離過濾，對嚴(yán)重偏分離的標(biāo)記進(jìn)行過濾（P<0.001）。長度小于20 kb以下的bin被篩除，過濾掉非染色體上的bin，最后以bin為作圖標(biāo)記進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建。使用MapQTL軟件結(jié)合重組自交系的表型對果皮底色、種皮顏色和果實(shí)苦味進(jìn)行連鎖分析。

結(jié)果與分析：（1）通過對RIL群體和親本進(jìn)行重測序，分別得到177.08 Gbp、7.67 Gbp和8.81Gbp的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。Q30超過85%，CG的平均含量接近35%?！?904‘Handel和重組自交系群體測序的平均覆蓋深度為17 X、19 X和2.99 X。親本基因組平均覆蓋度均在99.42%以上，重組自交系平均覆蓋度在89.28%以上。基因組基本被覆蓋，整體分布均勻，說明測序的整體隨機(jī)性較好。（2）構(gòu)建的西瓜高密度遺傳圖譜包含11條連鎖群，由2 132個(gè)重組bin標(biāo)記組成，上圖SNP有103 029個(gè)，圖譜總長度1508.94 cM，平均圖距為0.74 cM（原圖2）。（3）共定位到3個(gè)顯著性位點(diǎn)（原圖6）：在1號(hào)染色體上定位到一個(gè)與果實(shí)苦味有關(guān)的位點(diǎn)qbt-c1-1，LOD值為58.361，位于Block876-Block1188之間，區(qū)間范圍為0-45.91 cM，解釋表型變異為82.927%。在3號(hào)染色體上定位到一個(gè)與種皮顏色有關(guān)的位點(diǎn)qrc-c3-1， LOD值為26.852， 位于Block3708-Block3722之間，區(qū)間范圍為31.705-32.505 cM，解釋表型變異為58.685%。在8號(hào)染色體上定位到一個(gè)與果皮顏色有關(guān)的位點(diǎn)qrc-c8-1， LOD值為18.353，位于Block8000-Block8110之間，區(qū)間范圍為142.728-154.742 cM，解釋表型變異為49.9425%。

結(jié)? ? 論：本研究構(gòu)建了一張西瓜高密度遺傳圖譜，并對果皮顏色、種皮顏色和果實(shí)苦味等果實(shí)相關(guān)性狀進(jìn)行了初定位分析，為果皮顏色、種皮顏色和果實(shí)苦味候選基因的精細(xì)定位及闡明其形成的分子機(jī)理等奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為西瓜分子標(biāo)記輔助育種的提供了工具。