雷公藤內(nèi)酯酮與2，6-二甲基-β-環(huán)糊精包合物的制備及性能研究

晉文 李飛楊 黃宇蓉 楊惠文 遲紹明 朱洪友 雷澤 趙焱

摘 要：通過飽和水溶液法制備了雷公藤內(nèi)酯酮（TN）和2，6二甲基β環(huán)糊精（DMβCD）的包合物，采用一維核磁共振氫譜（1H NMR）、二維核磁共振氫譜（2D NMR）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、X射線衍射（XRD）、掃描電子顯微鏡（SEM）和熱重分析（TG）等技術(shù)對TN/DMβCD包合物進行表征，推測可能的包合模式。Job曲線法表明， 主客體的包合比為1∶1，采用紫外可見光譜滴定法測定得穩(wěn)定常數(shù)為2891 L/mol。形成包合物后，TN的水溶解度由0.0018 mg/mL增至2.7 mg/mL，提高了150倍。體外釋放實驗表明，在12 h時包合物累積釋放率可達70%，而TN累積釋放率達70%需120 h。本研究為制備較高水溶性和低毒性的天然藥物活性分子提供了新途徑。

關(guān)鍵詞：雷公藤內(nèi)酯酮; 2，6二甲基β環(huán)糊精; 包合物; 水溶性; 體外釋放

1 引 言

雷公藤內(nèi)酯酮（Triptonide，TN，結(jié)構(gòu)見圖1）為從衛(wèi)矛科雷公藤中分離出的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一[1]。研究表明，TN除具有抗炎、免疫抑制、抗生育等多種藥理活性外[2]，還有優(yōu)異的抗腫瘤活性，如能有效抑制肺癌細胞、鼻咽癌等多種腫瘤細胞生長、促進細胞凋亡[3～5]，在白血病的治療方面也有顯著效果[6]。同時，這個活性分子具有較高的安全性，在較高的劑量下對肝臟和腎臟均無毒副作用，也不會降低血液中紅細胞和白細胞的數(shù)量[5]。TN作為一種天然活性成分，具有較大的應(yīng)用價值。但是TN較低的水溶性和生物利用度限制了其進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用[2，4，7]。Qi等[8]合成了一種能靶向釋放的2葡萄糖胺修飾的雷公藤內(nèi)酯衍生物; Tian等[9]使用聚精氨酸修飾TN，提高了其溶解度，并實現(xiàn)透皮遞送; Ling等[10]采用葉酸和十八烷基胺合成出可負載TN的囊泡，提高了TN的水溶解度，并實現(xiàn)其靶向和pH響應(yīng)釋放。然而，這些方法存在成本偏高、合成困難、毒副作用較大等問題，限制了它們的應(yīng)用。因此，進一步研究新型藥物載體以提高TN的水溶性和生物利用度具有重要意義。

環(huán)糊精（ Cyclodextin，CD）具有疏水的空腔和親水的表面，使其能包合疏水性藥物從而改善藥物分子的物化性質(zhì)。因此，CD及其衍生物作為藥物載體已成為超分子化學(xué)的研究熱點之一[11～23]。近期， 本研究組通過多胺修飾βCD的包合作用增溶槲皮素、花旗松素和黃岑素等黃酮類化合物，使其水溶性分別提高了80～508倍，并且包合后花旗松素的抗氧化活性得到提高[24～26]。2，6二甲基β環(huán)糊精（DMβCD）作為一種安全性好的藥用輔料，由于低價易得、水溶性較好、低毒性因而在藥學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[19]。然而，采用CD及其衍生物改善TN的水溶性研究未見報道。因此，本研究采用飽和水溶液法制備TN和DMβCD的固態(tài)包合物，用紫外光譜滴定法研究DMβCD對TN的包合行為，進一步研究包合物的熱穩(wěn)定性、水溶性和體外釋放度。本研究為制備較高水溶性和低毒性的天然藥物活性分子提供了新途徑。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV8000S型紫外可見分光光度計（上海元析公司）; DRX500型核磁共振儀（德國Bruker公司）; Nicolet IS10型紅外光譜儀（美國Thermo科技有限公司）; DX2700型X射線衍射儀（丹東浩元公司）; Flex1000型掃描電子顯微鏡（日本日立高新公司）; STA449F3型熱重分析儀（德國Netzsch 公司）。

TN（純度>99%，成都曼斯特生物科技有限公司）; DMβCD （分析純，東京化成工業(yè)株式會社）。其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 TN/DMβCD包合物的制備采用飽和水溶液法制備包合物[25]。準確稱取0.01 mmol DMβCD 溶于3 mL水中，稱取0.03 mmol TN溶于2 mL無水乙醇中。將TN的乙醇溶液加入到上述DMβCD溶液中，密封，45℃下攪拌反應(yīng)4天。 在45℃干燥，將所得固體溶于少量水中，采用0.45 μm纖維素膜過濾。所得濾液在50℃下真空干燥，得到白色包合物。

2.3 Job曲線測定

用Job曲線法測定TN/DMβCD包合物的包和比。采用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.20）配制溶液，保持TN和DMβCD的總濃度為4.0×10-5 mol/L。測定TN/DMβCD摩爾比為0～1的溶液在TN最大吸收波長λmax=204 nm處的吸光度。

2.4 紫外可見光譜滴定實驗

固定TN濃度為5.0×10-5 mol/L，分別加入不同體積的1.0×10-2 mol/L DMβCD溶液，使每份溶液中DMβCD的濃度分別為0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0 mmol/L。溶劑為乙醇PBS混合液（1∶4， V/V， pH=7.20），測定以上溶液的紫外可見吸收光譜。

2.5 TN的標準曲線

使用無水乙醇配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06和0.07×10-3 mmol/L的TN溶液，并測定其在λmax=215 nm處的吸光度， 得其標準曲線方程為A=10200.7143C-0.006199，R2=0.9968 （n=7）。

2.6 TN/DMβCD包合物的水溶性實驗

通過飽和水溶液法測定包合物在水中的溶解度[27]。稱取過量的包合物溶于400?mL 水中，制備過飽和溶液，在25℃下恒溫2 h，期間短暫超聲3次，9000 r/min離心10 min，取50?mL上層清液，用無水乙醇定容至5 mL，利用紫外分光光度計測量待測液在215 nm處的吸光度。

2.7 X射線粉末衍射、掃描電子顯微鏡和熱重分析

X射線粉末衍射（XRD）測定條件為（Cu靶Kα為1.54056 ）： 工作電壓40 kV，電流35 mA，掃描步寬0.02°，采樣時間0. 2 s，起止角度為5°～50°。

分別稱取10.0 mg TN、10.0 mg DMβCD和10.0 mg TN/DMβCD包合物，用熱重分析儀進行測定，設(shè)定升溫范圍20～800℃，升溫速率10℃/min，N2流速為70 mL/min。最后分別測得空白樣品和包合物的熱重分析（TG）曲線。

將適量的TN、DMβCD、TN/DMβCD物理混合物、TN/DMβCD包合物分別固定在載物臺上，在電子加速電壓為5或3 kV條件下進行掃描電子顯微鏡（SEM）測試。

2.8 體外釋放實驗

TN和包合物的體外釋放實驗在溫度為37℃，pH=7.20的PBS溶液中進行[28]。將6 mg TN原料藥溶解于10 mL 無水乙醇中，置于潔凈的透析袋（截留分子量為1000 Da，美國Spectrumlabs公司）內(nèi)，然后將透析袋懸浮在含有400 mL PBS溶液的燒杯中， 在攪拌條件下進行透析，轉(zhuǎn)速為100 r/min。 按照預(yù)定的時間間隔，從燒杯中取4 mL PBS溶液測定，同時補充相等體積的新鮮PBS溶液到燒杯中。取用載藥量相同的包合物溶于水中，采用同樣的方法進行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 Job曲線

通過Job法測定DMβCD與TN之間的包合比。如圖2所示。DMβCD的摩爾分數(shù)為0.5時，Job曲線出現(xiàn)最大值，表明DMβCD與TN的包合比為1∶1。

3.2 紫外可見吸收光譜滴定

如圖3a所示，TN單獨存在時的紫外最大吸收波長204 nm（ε=9526 L/mol·cm），這是由含有α， β不飽和羰基的二萜類化合物ππ*躍遷產(chǎn)生的K帶吸收[29]。如圖3b～3k所示，隨著DMβCD的加入，TN的吸光度值逐漸增大，并伴隨最大吸收峰輕微的藍移，表明DMβCD與TN發(fā)生了相互作用，形成了包合物。

3.3 一維核磁共振氫譜（1H NMR）

客體分子在與CD包合過程中會導(dǎo)致主客體的化學(xué)位移發(fā)生變化，這些變化證明了包合物的形成，因此1H NMR技術(shù)可作為一種有效的CD包合物的表征方法[14]。如圖4所示，a為TN，b為DMβCD，c為TN/DMβCD包合物的1H NMR圖。由圖4可見，DMβCD的化學(xué)位移主要集中在δ=3.0～4.0 ppm處，而TN中特征氫的化學(xué)位移主要集中在δ=0.7～3.0 ppm之間，包合物中既包含了DMβCD的特征峰，又包含了TN的特征質(zhì)子峰。同時，如表1所示，形成包合物后，除H4和H6外，DMβCD中其它質(zhì)子的化學(xué)位移值都向高場輕微移動（Δδ=0.01～0.03 ppm），且H3的Δδ數(shù)值大于H5，表明TN分子由H3一側(cè)即大口端進入DMβCD的空腔內(nèi)。并且，包合物形成后，DMβCD的峰型也發(fā)生了微小變化，這表明TN/DMβCD包合物已形成。

3.4 二維核磁共振氫譜 （2D NMR）

二維旋轉(zhuǎn)坐標系豪澤效應(yīng)譜（2D ROESY）常用于推測包合物的包合模式。由于CD的H2和H4位于空腔外，H3和H5位于CD的空腔內(nèi)，而H1容易受到溶劑的影響，故通常用CD的H3和H5與客體質(zhì)子相互作用的交叉峰進行包合模式分析[19]。圖5為TN/DMβCD包合物的2D ROESY譜圖，有3個明顯的NOE相關(guān)點區(qū)域：a和c區(qū)域顯示TN的H16′和H15′與DMβCD的H3、H5均有相關(guān)，且與H3的相關(guān)性強于H5; b區(qū)域顯示TN的H17′與DMβCD的H3、H5都有明顯的NOE相關(guān)點。由于H3位于CD的大口端，H5位于小口端，表明TN的H15′、H16′和H17′質(zhì)子從大口端進入到CD的空腔中，且H17′進入的更加深入一些，與1H NMR得到的結(jié)果一致。結(jié)合其包合比為1∶1，分析得到TN/DMβCD包合物可能的包合模式如圖6所示。

3.5 紅外吸收光譜（FTIR）

使用KBr壓片法測定了TN（圖7A）、DMβCD（圖7B）、TN/DMβCD物理混合物（圖7C）和TN/DMβCD包合物（圖7D）的紅外吸收光譜圖。如圖7所示，DMβCD和TN的紅外光譜圖具有明顯差異。TN的特征吸收峰主要集中在3471、2984、2939和1764～538 cm1處，而DMβCD的特征吸收峰主要集中在3418、2934、2839和1644～576 cm1。形成包合物后，CD上的OH伸縮振動峰由3418 cm1位移至3414 cm1，且峰型發(fā)生了變化，CH伸縮振動峰由2934和2839 cm1位移至2930和2841 cm1，CC伸縮振動由1644 cm1位移至1663 cm1，且峰形發(fā)生變化; TN在2984 cm1處的CH伸縮振動峰消失，CO伸縮振動峰由1764和1723 cm1位移至 1759和1727 cm1，1000～400 cm1處的彎曲振動吸收峰消失。與包合物相比，物理混合物的紅外光譜圖只是二者特征吸收峰的簡單疊加，其在3418和1644 cm1處的吸收峰并未產(chǎn)生位移，且峰形無變化，同時在1764 cm1處出現(xiàn)了TN的特征吸收峰。由此推斷，形成了TN/DMβCD包合物，而非物理混合物。

3.6 XRD粉末衍射

圖8為TN（圖8A）、DMβCD（圖8B）、TN/DMβCD物理混合物（圖8C） 和TN/DMβCD包合物（圖8D）的X射線粉末衍射 （XRD）圖譜。TN展現(xiàn)出晶體的形態(tài)特征，包合物并未展現(xiàn)晶體的形態(tài)特征，而是呈現(xiàn)出與DMβCD更加相似的非晶體形態(tài)特征，物理混合物與包合物有明顯區(qū)別，同時呈現(xiàn)了晶體和非晶體的形態(tài)特征，是DMβCD與TN形態(tài)特征的簡單疊加。與DMβCD相比，包合物的XRD譜圖在2θ=12°的衍射峰變得更加尖銳，并在2θ=25°出現(xiàn)了新的衍射峰。形成包合物后，TN在2θ=8°、12°、16°、28°、31°、36°和46° 的衍射峰消失。這些結(jié)果表明形成了TN/DMβCD包合物。

3.7 SEM分析

通過SEM觀察包合物的外部形貌。如圖9所示，TN呈薄片形狀（圖9A），DMβCD呈小球形狀（圖9B），物理混合物（圖9C）中既有薄片形狀的TN，又有小球狀的DMβCD，為兩者形貌的簡單混合，而包合物不同于主客體的形貌，呈現(xiàn)了不規(guī)則的塊狀形貌，并不是簡單的主客體形貌的混合（圖9D），表明主客體之間形成了包合物。

3.8 熱重分析

如圖10所示，TN（圖10a）有兩個失重過程，從19.0℃開始失重，100.8℃失重結(jié)束，失重率為7.67%，這一階段主要是TN失水過程，此后不再失重; 第二階段是從280.0℃開始失重，585.0℃失重結(jié)束，這一階段是TN 的熱分解過程，此過程失重率為64.33%。DMβCD（圖10b）有兩個失重階段，第一個階段是19.5～120.6℃，失重率為8.67%，這一階段主要是DMβCD失水過程，此后不再失重; 第二階段是300～420.0℃，失重率為76.50%，這一階段是DMβCD 的熱分解過程。TN/DMβCD包合物（圖10c）有兩個失重階段，第一階段是20.0～100.4℃的失水階段，失重率為8.56%; 第二個階段是105.6～298.4℃，這是一個很緩慢的失重過程，這一階段是受熱后，部分TN從βCD空腔緩慢釋放的過程，失重率為4.20%，在溫度達到300.0℃后，βCDTN包合物開始分解，到405.4℃結(jié)束，失重率為68.50%，TN/DMβCD包合物的失重過程不同于主客體，進一步證明包合物的形成。

3.9 包合物水溶性分析

通過飽和水溶液法[27]，測得TN在水中的溶解度為0.018 mg/mL，而包合物在水中溶解度達到了2.7 mg/mL。這是由于DMβCD具有疏水的空腔和親水的表面，使其可通過非共價鍵相互作用與水溶性差的TN形成包合物，借助DMβCD本身良好的水溶性，使TN的水溶解度提高了150倍。

3.10 體外釋放實驗

參考文獻＼[28＼]的方法進行TN及其包合物的體外釋放實驗。TN（a）和TN/DMβCD包合物（b）在PBS溶液（pH=7.20）中的體外釋放情況如圖11所示，24 h后，包合物累計釋放率可達到75%，而TN僅有50%; 12 h后，包合物累積釋放率達到70%，而TN累積釋放率達70%需要120 h。因此， 形成包合物后，TN的體外釋放速率得到顯著提高。其原因可能是DMβCD作為一種水溶性藥物賦形劑，包合TN后顯著提高其水溶解度，有助于難溶性藥物的擴散[32]; 另一方面，形成包合物后，TN的結(jié)晶度有所降低，也有利于藥物的釋放[33]。

4 結(jié) 論

制備了TN和DMβCD的包合物，研究了DMβCD對TN的包合行為。水溶解度實驗表明，形成包合物后，TN的水溶性由0.018 mg/mL提升至2.7 mg/mL， 提高了150倍，在體外釋放實驗中的12 h累積釋放率達到70%，釋放的時間縮短了10倍，包合物相比較原料藥具有體外釋放速度更快的特點。本研究為制備較高水溶性和低毒性的天然藥物活性分子提供了新途徑。

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