GC-MS/MS 法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)過程控制應(yīng)用于煙用香精的質(zhì)量監(jiān)控

蔣成勇，杜國(guó)榮，王麗達(dá)，張 杰，嚴(yán)莉紅，白若石，鄭曉曼，蘆 楠，周 駿

上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心北京工作站，北京市通州區(qū)萬盛南街99 號(hào)101121

煙用香精的質(zhì)量監(jiān)控一直是香精企業(yè)和卷煙生產(chǎn)企業(yè)高度關(guān)注的問題，目前，主要依照系列行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定煙用香精折光指數(shù)、相對(duì)密度和酸值等指標(biāo)來監(jiān)控香精質(zhì)量[1]。然而，煙用香精是一個(gè)復(fù)雜的多組分體系，各組分對(duì)香味的貢獻(xiàn)存在協(xié)同效應(yīng)，即使含量極少的香氣組分也可能對(duì)卷煙的感官品質(zhì)產(chǎn)生較大影響[2]。因此，對(duì)煙用香精中全組分香氣成分進(jìn)行監(jiān)控，不僅可以清楚地了解香精的內(nèi)在品質(zhì)，還可以掌握各批次香精的質(zhì)量波動(dòng)情況，有助于穩(wěn)定卷煙產(chǎn)品質(zhì)量。

通過化學(xué)組分監(jiān)控?zé)熡孟憔|(zhì)量，主要采用氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）、全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（GC×GC-TOFMS）和液相色譜法（HPLC）等分析手段結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法[3-12]。GC-MS/MS 近年來發(fā)展迅速，已在農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染物、煙草化學(xué)等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[13-16]，由于該方法選擇性好且具有高通量和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，因此在煙用香精復(fù)雜體系的分析方面具有較大的應(yīng)用空間。

采用多元統(tǒng)計(jì)過程控制（Multivariate Statistical Process Control，MSPC）方法進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，主要是利用正常狀態(tài)下的樣品測(cè)量信息建立多元統(tǒng)計(jì)模型，將大量的過程變量通過多元統(tǒng)計(jì)的方法投影到由少量隱變量定義的低維空間中，并通過計(jì)算各樣品的統(tǒng)計(jì)量（如Hotelling T2、平方預(yù)測(cè)誤差Q等）和以統(tǒng)計(jì)量建立控制圖，使過程監(jiān)控、質(zhì)量檢測(cè)及相應(yīng)研究得到簡(jiǎn)化[17]。近年來，MSPC 技術(shù)在藥物制造、食品與飼料生產(chǎn)、卷煙制絲過程等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[18]。

本研究中采用GC-MS/MS 分析方法結(jié)合基于主成分分析的MSPC 技術(shù)，建立煙用香精質(zhì)量監(jiān)控評(píng)價(jià)方法，通過監(jiān)測(cè)香氣成分變化實(shí)現(xiàn)煙用香精的質(zhì)量監(jiān)控，旨在為進(jìn)一步研究卷煙產(chǎn)品加香工藝、產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控及卷煙調(diào)香提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

配方香精A（溶劑為乙醇和丙二醇）為卷煙表香香精產(chǎn)品，由北京卷煙廠提供。

無水乙醇、丙酮、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)Fisher 公司）；丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、（+）-檸檬烯、異丁酸異戊酯、異戊醇、正己酸乙酯、異戊酸丁酯、丁酸異戊酯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、異戊酸異戊酯、丁酸戊酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸異戊酯、對(duì)甲苯甲醚、辛酸乙酯、乙酸、己酸異戊酯、過氧化乙酰丙酮、苯甲醛、丙酸、芳樟醇、乙酸芳樟酯、5-甲基糠醛、β-石竹烯、γ-戊內(nèi)酯、乙酰丙酸乙酯、γ-丁內(nèi)酯、薄荷醇、苯乙酮、苯甲酸乙酯、糠醇、丁二酸二乙酯、異戊酸、乙酸松油酯、α-松油醇、十二醛、乙酸橙花酯、乙酸芐酯、2-甲基戊酸、苯乙酸乙酯、甲基環(huán)戊烯醇酮、α-紫羅蘭酮、苯甲醇、乙基環(huán)戊烯醇酮、苯乙醇、β-紫羅蘭酮、麥芽酚、β-氧化石竹烯、乙基麥芽酚、對(duì)茴香醛、4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）呋喃酮、反式-橙花叔醇、DL-蘋果酸二乙酯、十四酸乙酯、肉桂酸甲酯、肉桂酸乙酯、對(duì)甲氧基苯乙酮、對(duì)甲氧基苯基丙酮、丁香酚、棕櫚酸乙酯、茴香醇、異丁香酚、芐醚、十八酸乙酯、5-羥甲基糠醛、乙基香蘭素、香蘭素、苯甲酸芐酯、3-羥基-4-甲氧基苯甲醛等72 種香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（95%～99%，北京百靈威科技有限公司）；苯甲酸正丙酯（99%，日本TCI 公司）。

7890B-7000D 型GC-MS/MS、MassHunter QQQ定量分析軟件（Version B.07.01 SP1）（美國(guó)Agilent公司）；D-78224 型超聲波清洗儀（德國(guó)Elma 公司）；PI-214 型電子天平（感量0.000 1 g，美國(guó)Denver Instrument 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5 g 苯甲酸正丙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇定容于100 mL 容量瓶中，得質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。移取0.1 mL 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于100 mL 容量瓶中，用無水乙醇稀釋并定容，得質(zhì)量濃度為50的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別稱取香氣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.1 g（精確至0.1 mg），用丙酮溶解后定容于100 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)樣品混合液，并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用前將其恢?fù)至室溫。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.1 mg）試樣于25 mL具塞三角瓶中，加入10 mL 丙酮和內(nèi)標(biāo)溶液，再加入5 g 無水硫酸鈉，輕搖至無水硫酸鈉不變化；超聲提取5 min，靜置5 min；將提取液用微孔濾膜過濾，進(jìn)行GC-MS/MS 分析。分析條件為：

色譜柱：DB-WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：1 μL，不分流進(jìn)樣；恒流模式，柱流量1 mL/min；升溫程序：初始溫度45 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 的速率升溫至200 ℃，再以10 ℃/min 的速率升溫至240 ℃，保持5 min。電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；Q1 和Q3 溫度：150 ℃；碰撞氣：N2（99.999%），流速1.5 mL/min；淬滅氣：He，流速2.25 mL/min；掃描方式：Scan、SIM、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。

1.2.3 感官評(píng)價(jià)

以配方香精A 為表香的“中南海”卷煙產(chǎn)品作為對(duì)照樣，采用調(diào)整不同添加比例（±20%、±10%、±5%）的配方香精A 制作待測(cè)樣品卷煙；按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 138—1998《煙草及煙草制品 感官評(píng)價(jià)方法》，組織7 名具有資質(zhì)的評(píng)吸人員組成評(píng)吸小組對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)；采用三點(diǎn)檢驗(yàn)法評(píng)估待測(cè)樣品與對(duì)照樣之間差異顯著性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

在MassHunter QQQ 定量分析工作站打開采集的MRM 數(shù)據(jù)，利用編輯好的分析方法對(duì)目標(biāo)物峰進(jìn)行自動(dòng)積分，得到各目標(biāo)物的峰面積。用相對(duì)峰面積（各目標(biāo)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值）對(duì)樣品進(jìn)行半定量分析。采用基于PCA 的MSPC 方法對(duì)正常狀態(tài)下采集的煙用香精成分半定量結(jié)果進(jìn)行分析并建立模型，計(jì)算統(tǒng)計(jì) 量Hotelling T2，以3σ 為 控 制 上 限，繪 制 控制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 全組分香氣成分定性分析

選擇不同極性溶劑（乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和環(huán)己烷）和不同色譜柱（DB-5MS 和DBWAX）對(duì)香精樣品進(jìn)行提取和分離，采用3 種方式進(jìn)行全組分香氣成分定性分析。①保留時(shí)間確認(rèn)：以GC-MS 全掃描方式分析待測(cè)樣品，首先通過NIST 譜庫匹配確定目標(biāo)香氣成分，然后比較標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)樣品中目標(biāo)香氣成分保留時(shí)間的一致性。②標(biāo)準(zhǔn)加入法：將配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液加入到香精樣品中進(jìn)行提取和分析，并與未加入標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的樣品進(jìn)行對(duì)比分析，目標(biāo)香氣成分的色譜峰顯著增高。③MRM 監(jiān)測(cè)：針對(duì)每種目標(biāo)香氣成分，通過優(yōu)化碰撞電壓，挑選出兩對(duì)離子對(duì)分別用于定量和定性分析。從配方香精A 中共鑒定出72 種全組分香氣成分，其MRM 參數(shù)見表1。由于三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜具有高通量離子傳輸性能和碰撞室零串?dāng)_技術(shù)特點(diǎn)，因此可有效解決重疊組分和基質(zhì)干擾問題，進(jìn)而提高定性和定量的準(zhǔn)確性。

2.2 提取分析方法優(yōu)化

表1 72 種香氣成分定性分析參數(shù)及方法學(xué)評(píng)價(jià)Tab.1 Qualitative parameters of 72 aroma components and methodology evaluation

表1（續(xù)）

表1（續(xù)）

2.2.1 分離色譜柱的選擇

由于配方香精A 中香氣成分種類較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且極性差異較大，部分化合物如乙酸、丙酸、異戊酸等極性香氣成分相對(duì)含量較高，但其在非極性色譜柱（DB-5MS）上的保留能力較小且易造成較高的柱流失。因此，為了最大限度獲取全組分香氣成分，選擇DB-WAX 柱進(jìn)行香氣成分分離。

2.2.2 提取溶劑的選擇

分別稱取5 份同一批次香精樣品各0.5 g 于5個(gè)25 mL 具塞三角瓶中，分別以乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和環(huán)己烷為溶劑，考察提取溶劑對(duì)香氣成分提取效率的影響，結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果表明，以丙酮為溶劑提取出的香氣成分?jǐn)?shù)量最多且總量最高。香精中香氣成分種類多、性質(zhì)差異大，而丙酮是偏極性溶劑，可以更好地提取多種成分，因此選擇丙酮作為提取溶劑。

圖1 溶劑對(duì)提取效率的影響Fig.1 Influence of solvent on extraction efficiency

2.2.3 提取時(shí)間的優(yōu)化

分別稱取6 份同一批次香精樣品各0.5 g 于25 mL具塞三角瓶中，加入5 g無水硫酸鈉、10 mL 丙酮和20內(nèi)標(biāo)溶液，考察超聲提取時(shí)間（5、10、15、20、30 和40 min）對(duì)香氣成分提取效率的影響。結(jié)果（圖2）表明，超聲時(shí)間對(duì)香氣成分的提取結(jié)果影響較小，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.52%。綜合考慮，選取超聲提取時(shí)間為5 min。

圖2 時(shí)間對(duì)提取效率的影響Fig.2 Influence of time on extraction efficiency

2.2.4 料液比的選擇

分別稱取5 份同一批次香精樣品各1.0 g 于50 mL 具塞三角瓶中，分別加入5 g 無水硫酸鈉、不同體積（5、10、15、20 和30 mL）丙酮和相應(yīng)量的內(nèi)標(biāo)溶液，超聲提取5 min 后進(jìn)樣分析，考察料液比（g∶mL）對(duì)香氣成分提取效率的影響，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，香氣成分的提取量隨料液比的減小而增大，當(dāng)料液比＜1∶20 時(shí)，香氣成分的提取量趨于穩(wěn)定。因此確定料液比為1∶20。

圖3 溶劑體積對(duì)提取效率的影響Fig.3 Influence of solvent volume on extraction efficiency

2.3 方法的檢出限、回收率和重復(fù)性

取1.2.1 中配制的香氣成分標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用丙酮定容于100 mL容量瓶，配制成濃度為10的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-MS/MS 分析，以3 倍信噪比為檢出限。結(jié)果（表1）表明，大多數(shù)香氣成分的檢出限均小于1.0 ng/mL。

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法在高、中、低3 個(gè)濃度下考察香氣成分的回收率。結(jié)果（表1）表明，香氣成分的加標(biāo)回收率為80%～120%。

以日內(nèi)測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和日間測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性來評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。對(duì)同一批次樣品在1 d內(nèi)進(jìn)行15 次平行處理和檢測(cè)，計(jì)算RSD；對(duì)同一批次樣品每天平行測(cè)定5 次，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算RSD。結(jié)果（表1）表明，大多數(shù)香氣成分的日內(nèi)重復(fù)性（RSD）＜3%，日間重復(fù)性＜5%，說明本方法重復(fù)性較好。

2.4 香精質(zhì)量監(jiān)控模型的建立及應(yīng)用

2.4.1 模型的建立

選擇12 個(gè)批次配方香精A進(jìn)行GC-MS/MS 分析，每個(gè)批次樣品抽樣測(cè)定5 次，獲取60 個(gè)樣品的72 種香氣成分的半定量分析結(jié)果。由于香氣成分含量差別較大，而其對(duì)感官質(zhì)量的貢獻(xiàn)也有差異。為了將香氣成分波動(dòng)對(duì)感官質(zhì)量的影響引入到質(zhì)量監(jiān)控模型，采用調(diào)整加香比例（±20%、±10%、±5%）的方式制作樣品卷煙進(jìn)行感官評(píng)吸。結(jié)果表明，增加5%的香精用量，感官質(zhì)量無明顯差異，其余加香比例則出現(xiàn)不同程度的感官質(zhì)量差異。因此，將增加5%加香比例的配方香精香氣成分分析結(jié)果作為建模樣本數(shù)據(jù)，并建立煙用香精質(zhì)控模型。

基于PCA 方法建立MSPC 模型時(shí)，一般要求主成分的累積貢獻(xiàn)率大于85%。本研究中采用累積方差貢獻(xiàn)率對(duì)不同主成分?jǐn)?shù)進(jìn)行了分析。結(jié)果（圖4）表明，主成分?jǐn)?shù)為5 時(shí)累積貢獻(xiàn)率可達(dá)到90%，因此采用5 個(gè)主成分計(jì)算Hotelling T2。

圖4 主成分?jǐn)?shù)對(duì)累計(jì)貢獻(xiàn)率的影響Fig.4 Influence of number of principal components on cumulative contribution rate

配方香精A 的質(zhì)量監(jiān)控模型見圖5。其中，1～60 號(hào)為12 個(gè)批次合格樣品，61～65 號(hào)為加香比例增加5%時(shí)感官評(píng)吸合格樣品。以3σ 為控制上限繪制控制圖，由圖5 可見，建模樣品質(zhì)量雖略有波動(dòng)，但總體穩(wěn)定，T2值均在3σ 控制上限以內(nèi)。2 個(gè)批次待測(cè)香精樣品（66～75 號(hào)）的質(zhì)量判定結(jié)果表明，Hotelling T2值都處于3σ 質(zhì)量控制限以內(nèi)，說明香精質(zhì)量穩(wěn)定。

圖5 模型控制圖及待測(cè)樣品預(yù)測(cè)Fig.5 Model control chart and predictio n of test samples

2.4.2 模型的應(yīng)用

針對(duì)實(shí)際生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的加香精度差異造成的香氣成分含量變化，可以通過該模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。圖6 所示76～80、81～90 號(hào)分別為調(diào)整加香比例-5%和±10%時(shí)感官質(zhì)量存在顯著差異的香精樣品，Hotelling T2計(jì)算結(jié)果均超出控制上限，說明配方香精香氣成分相對(duì)含量發(fā)生改變，該情況完全可以通過該模型進(jìn)行直觀呈現(xiàn)，并且預(yù)測(cè)結(jié)果與感官質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果一致。

圖6 異常樣品預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of abnormal samples

為了進(jìn)一步反映配方香精批次間的差異情況，基于該模型對(duì)香精樣品的主成分狀態(tài)進(jìn)行了分析。圖7A 顯示，14 個(gè)批次合格香精都在置信橢圓內(nèi)，而異常樣品（76～90 號(hào)）則偏離較大。批次1和批次2 相較于其他批次略有差異（圖7B）。圖8中紅色和黑色實(shí)線分別表示1、2 批次和其余批次香精香氣成分含量變化趨勢(shì)，從A、B、C 區(qū)域可以看出，2-甲基丁酸-2-甲基丁酯（11 號(hào)）、乙酰丙酸乙酯（29 號(hào)）、異丁香酚（65 號(hào)）等香氣成分出現(xiàn)明顯的異常波動(dòng)，原因可能是1、2 批次樣品存放時(shí)間超過2 年，其內(nèi)在香氣成分可能發(fā)生一定的化學(xué)變化，從而影響香精的整體質(zhì)量，該結(jié)果可為過期香精的復(fù)檢工作提供技術(shù)保障。因此，通過監(jiān)控香氣成分變化可以更加客觀地反映香精的內(nèi)在質(zhì)量，且監(jiān)測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性較高。

圖7 煙用香精主成分分析結(jié)果Fig.7 Principal component analysis of tobacco flavor

圖8 目標(biāo)香氣成分含量變化趨勢(shì)Fig.8 Variation trend of contents of target aroma components

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測(cè)定煙用香精全組分香氣成分的GC-MS/MS 分析方法，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，準(zhǔn)確性好，香氣成分的檢出限一般都小于1.0 ng/mL，日內(nèi)和日間重復(fù)性（RSD）都在3%和5%以內(nèi)，加標(biāo)回收率達(dá)到80%～120%。GC-MS/MS 分析方法結(jié)合基于主成分分析的MSPC 技術(shù)，建立的質(zhì)量監(jiān)控模型能夠快速、準(zhǔn)確地從客觀上反映煙用香精的內(nèi)在質(zhì)量波動(dòng)情況，可以作為煙用香精質(zhì)量監(jiān)控的有效手段。