卵巢早衰患者血漿中miRNA-503的作用及對內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響

仝慧杰 劉麗麗 范志剛 李陽 馮曉娟

河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺市人民醫(yī)院（河北邢臺054000）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）指40歲之前的女性由于卵巢功能衰退而引發(fā)持續(xù)性閉經(jīng)和性器官萎縮的綜合征［1］。卵巢動脈的血流阻力增加，灌注量降低是引起卵巢早衰的病理機制［2-3］。研究［4-6］發(fā)現(xiàn)，miRNA-503 具有抗血管生成的作用，參與調(diào)節(jié)多種血管生成因子，但是miRNA-503 是否參與卵巢早衰的血管抑制過程尚無報道。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可遷移至損傷位點，支持或替代損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，從而發(fā)揮促血管生成的作用［7］。外周血中EPCs 數(shù)量降低以及功能減弱常見于各種疾?。?-10］，但是卵巢早衰患者外周血EPCs的變化，以及與miRNA-503 是否具有相關(guān)性，尚不清楚。綜上，本文旨在探討卵巢早衰患者血漿中miRNA-503水平和內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的變化，并且分析其相關(guān)性，以及miRNA-503與彩色多普勒血流動力學(xué)參數(shù)的關(guān)系，并且通過體外細(xì)胞學(xué)實驗研究miRNA-503對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和黏附的影響。

1 資料與方法

1.1 資料選取2016年1月至2018年12月于我院就診的24 例卵巢早衰患者作為卵巢早衰組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≤40歲的已婚患者，月經(jīng)初潮及第二性征發(fā)育正常；（2）閉經(jīng)時間≥6 個月；（3）2 次或以上檢查發(fā)現(xiàn)血清FSH≥40 mIU/mL，兩次檢查需間隔1 個月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）3 個月內(nèi)服用過激素類藥物或針對卵巢早衰進行過治療；（2）合并腫瘤、高血壓等其他疾病。納入同期體檢、年齡相近（≤2 歲）的24 例健康女性作為對照組。收集兩組患者的一般資料進行比較，包括年齡、促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）等。所有患者均已簽署知情同意書，本研究已獲倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 血漿miRNA-503 含量的檢測實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定miRNA-503的含量，常規(guī)對患者血漿行RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR 擴增等步驟。引物合成于上海生工生物工程有限公司，具體序列為：miRNA-503的上游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物：5′-GCTAGCAGCGGGAACAG-3′；U6的上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 EPCs 數(shù)量的檢測抽取患者2 mL的抗凝靜脈血，淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶科技有限公司）分離淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞分別與APC-CD34 抗體（美國Thermo Fisher Scientific 公司）和FITC-VEGFR2 抗體（英國Abcam 公司）避光孵育10 min，洗滌后使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 卵巢動脈血流動力學(xué)參數(shù)的檢測使用彩色多普勒超聲診斷儀（荷蘭Philips 公司）經(jīng)陰道觀察卵巢基質(zhì)內(nèi)動脈血流，測量收縮期峰值流速（peak systolic velocity，PSV）、舒張末期流速（end-diastolic velocity，EDV）、阻力指數(shù)（resistive index，RI）、搏動指數(shù)（pulsatility index，PI）。

1.5 細(xì)胞學(xué)實驗

1.5.1 EPCs的分離、培養(yǎng)與鑒定參照文獻報道［11］進行實驗：分離外周血淋巴細(xì)胞后，使用EGM-2 完全培養(yǎng)基（瑞士Lonza 公司）以2×106個/L的密度接種于6 孔板中，放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，后續(xù)實驗均使用第3 代細(xì)胞。4%的多聚甲醛固定EPCs 細(xì)胞，加入Dil-LDL 染色液（工作濃度：2.4 mg/L，美國Molecular Probes 公司）與FITC-UEAI 染色液（工作濃度：10 mg/L，美國Sigma 公司）于37 ℃孵育1 h，倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.5.2 實驗分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞學(xué)實驗分為4組，即正常對照組（A 組）、卵巢早衰組（B 組）、miRNA-503 inhibitor NC 組（C 組）、miRNA-503 inhibitor 組（D組）。A組使用無卵巢早衰女性分離得到的EPCs。其余三組均使用卵巢早衰患者分離得到的EPCs，B 組未進行轉(zhuǎn)染；C 組和D 組分別使用miRNA-503 inhibitor NC 和miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染，按照LipofectamineTM 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司）說明書進行實驗。72 h 后使用qRT-PCR 測定四組細(xì)胞中miRNA-503的表達水平。miRNA-503 inhibitor和miRNA-503 inhibitor NC 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計和合成。

1.5.3 IGF-1R 表達水平的檢測qRT-PCR 測定細(xì)胞中IGF-1R mRNA 表達水平，具體序列為：上游引物：5′-TCGACATCCGCAACGACTATC-3′，下游引物：5′-CCAGGGCGTAGTTGTAGAAGAG-3′。蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）測定四組細(xì)胞中IGF-1R蛋白質(zhì)的表達水平，常規(guī)進行電泳、轉(zhuǎn)印等步驟，一抗稀釋比例為：抗IGF-1R 抗體（1∶1 000，英國Abcam 公司）和抗GAPDH 抗體（1∶2 000，英國Abcam 公司）。

1.5.4 EPCs 增殖能力的檢測將等量EPCs 細(xì)胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)72 h，加入10 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清后加入二甲基亞砜振蕩10 min。酶標(biāo)儀于490 nm 處測定各孔吸光度值（OD）。

1.5.5 EPCs 黏附能力的檢測將等量的EPCs 細(xì)胞接種于6 孔板中，放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中30 min，PBS 洗去未貼壁的細(xì)胞，顯微鏡下計數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間計量數(shù)據(jù)的比較使用t檢驗，多組間計量數(shù)據(jù)的比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗。相關(guān)分析使用Pearson 法。所有計數(shù)數(shù)據(jù)均表示為患者例數(shù)，計數(shù)數(shù)據(jù)的比較使用χ2檢驗，等級頻數(shù)資料比較采用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較與對照組比較，卵巢早衰組患者的FSH、LH、妊娠次數(shù)和人流次數(shù)升高，E2降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其他一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data （n=24）±s

表1 一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data （n=24）±s

組別對照組卵巢早衰組t 或χ2值P 值年齡（歲）31.92±5.80 32.88±5.01 0.614 0.543體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）22.10±2.99 21.87±3.12 0.261 0.796初潮年齡（歲）13.75±1.87 14.08±2.16 0.566 0.574首次分娩年齡（歲）25.18±4.25 25.90±4.83 0.548 0.586哺乳時間（月）7.28±3.23 7.69±3.57 0.417 0.679月經(jīng)周期（d）29.44±3.12 28.72±3.66 0.733 0.467組別對照組卵巢早衰組t 或χ2值P 值經(jīng)期（d）5.19±1.34 5.42±1.56 0.548 0.586 FSH（mIU/mL）4.65±1.52 63.44±18.70 15.350＜0.001 LH（mIU/mL）6.88±3.59 27.10±13.38 7.150＜0.001 E2（pg/mL）128.07±62.51 37.85±18.33 6.785＜0.001痛經(jīng)（例）46 0.505 0.477妊娠次數(shù)（次）0.74±0.13 1.13±0.45 4.079＜0.001卵巢早衰家族史（例）15 3.048 0.081人流次數(shù)（例）0 次18 11 Mann-Whitney U=196.000 0.030 1 次46≥2 次27

2.2 miRNA-503 表達水平、EPCs 數(shù)量的比較及相關(guān)性分析qRT-PCR 結(jié)果顯示，對照組和卵巢早衰組miRNA-503 表達水平分別為（0.71 ± 0.05）、（1.62 ± 0.12），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 6.769，P＜0.001）；EPCs 數(shù)量分別為（35.83±1.96）個/mL、（22.42±2.20）個/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.558，P＜0.001）。miRNA-503 表達水平和EPCs 數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.713，P＜0.001）。見圖1。

2.3 卵巢早衰患者miRNA-503 與卵巢動脈血流動力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析miRNA-503 表達水平與PSV 和EDV 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.508，P= 0.011；r=-0.497，P= 0.014），與RI 和PI 呈正相關(guān)（r=0.450，P=0.027；r=0.491，P=0.015），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖1 miRNA-503 表達水平、EPCs 數(shù)量的比較及相關(guān)性分析Fig.1 Comparison and correlation analysis of the expression level of microRNA-503 and the number of EPCs

圖2 miRNA-503 與卵巢動脈血流動力學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of microRNA503 and ovarian artery hemodynamic parameters

2.4 內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定FITC-UEA-I 染色陽性的細(xì)胞呈綠色熒光，Dil-Ac-LDL 染色陽性的細(xì)胞呈紅色熒光，合并圖片后呈橙黃色的細(xì)胞為雙重陽性染色細(xì)胞。見圖3。

圖3 內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定Fig.3 Identification of endothelial progenitor cells

2.5 miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染后EPCs 中miRNA-503、IGF-1R的表達qRT-PCR 結(jié)果顯示，A 組、B組、C 組、D 組miRNA-503 表達水平分別為（1.00 ±0.16）、（2.31±0.37）、（2.24±0.31）、（1.16±0.29），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=134.800，P＜0.001）。miRNA-503 表達水平B 組、C 組高于A 組，且D 組低于B、C組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4A。

qRT-PCR 和WB 結(jié)果顯示，A 組、B 組、C 組、D組IGF-1R mRNA 表達水平分別為（1.00 ± 0.14）、（0.35±0.17）、（0.31±0.21）、（0.78±0.18），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 86.680，P＜0.001）；IGF-1R 蛋白質(zhì)表達水平分別為（1.00±0.15）、（0.48±0.19）、（0.42±0.20）、（0.81±0.19），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.900，P＜0.001）。以上指標(biāo)B 組、C 組、D 組低于A 組，且D 組高于B、C 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4B、4C。

2.6 miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染后EPCs的增殖和黏附B、C、D 組的增殖、黏附水平均低于A 組，且D 組高于B、C 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖4 miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染后EPCs 中miRNA-503、IGF-1R的表達Fig.4 Expression of miRNA-503 and IGF-1R in EPCs after transfection with miRNA-503 inhibitor

表2 miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染后EPCs的增殖和黏附Tab.2 Proliferation and adhesion of EPCs after transfection with miRNA-503 inhibitor ±s

表2 miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染后EPCs的增殖和黏附Tab.2 Proliferation and adhesion of EPCs after transfection with miRNA-503 inhibitor ±s

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與卵巢早衰組比較，bP ＜0.05；與miRNA-503 inhibitor NC 組比較，cP ＜0.05

組別正常對照組（A 組）卵巢早衰組（B 組）miRNA-503 inhibitor NC 組（C 組）miRNA-503 inhibitor 組（D 組）F 值P 值增殖（OD 值）0.692±0.074 0.258±0.059a 0.231±0.063a 0.570±0.082abc 256.000＜0.001黏附（細(xì)胞數(shù)）69.40±8.51 32.77±6.19a 36.13±5.96a 61.82±9.08abc 140.700＜0.001

3 討論

卵巢早衰是各種原因?qū)е碌穆殉补δ芩ネ?，典型特征為FSH 和LH 水平升高，而E2水平降低，本研究也分析了納入患者的激素水平，與上述特征一致。卵巢早衰的發(fā)病危險因素包括妊娠、人流、家族史等，本文也發(fā)現(xiàn)卵巢早衰組患者的妊娠次數(shù)和人流次數(shù)高于對照組，與文獻［12］報道一致。雖然卵巢早衰組較對照組在家族史比例方面有升高的趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻［12］報道不一致，可能與本文納入患者的數(shù)量較少有關(guān)。

卵巢動脈可以為卵泡成熟提供循環(huán)支持，影響著卵巢儲備功能，血流灌注降低是卵巢早衰的主要病理機制之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-503可以抑制血管生成，其表達水平受到一系列血管生成相關(guān)因素的調(diào)節(jié)，包括缺氧、炎癥等［13］。本文結(jié)果顯示卵巢早衰組miRNA-503 表達水平明顯升高，提示miRNA-503 可能在卵巢早衰的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的病理作用。而且彩色多普勒超聲及相關(guān)分析結(jié)果顯示，隨著miRNA-503 表達水平升高，卵巢動脈的血液灌注量降低，而血管阻力增加，表明miRNA-503 高表達與卵巢動脈血流動力學(xué)減退相關(guān)。目前臨床上對卵巢早衰患者的病情程度及療效評價仍然以癥狀、激素、經(jīng)陰道超聲為主，但是這些指標(biāo)的量化性能較差，而miRNA-503水平檢測可能為定量評價提供一個新的選擇［14］。

EPCs 是一類主要參與血管生成的多能干細(xì)胞［15-16］。在各種疾病中外周血EPCs 數(shù)量會發(fā)生改變，如DENG 等［17］發(fā)現(xiàn)急性缺血性中風(fēng)患者的循環(huán)EPCs 水平顯著低于健康對照組。本文也檢測了CD34 和VEGFR2 雙陽性的EPCs 數(shù)量，發(fā)現(xiàn)卵巢早衰組患者較對照組外周血中EPCs 數(shù)量顯著降低，與上述文獻中的結(jié)論相近，即血管生成能力不足的疾病常伴隨有較低數(shù)量的循環(huán)EPCs。

miRNA 參與調(diào)節(jié)EPCs 增殖、黏附等功能［18］。本文對miRNA-503 表達水平和EPCs 數(shù)量進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈負(fù)相關(guān)，表明miRNA-503致卵巢早衰血流動力學(xué)減退的機制可能與EPCs有關(guān)。為了進一步探討miRNA-503 對EPCs的影響，本研究分離和培養(yǎng)了卵巢早衰患者EPCs，使用miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染可使細(xì)胞增殖和黏附水平升高，提示miRNA-503 對EPCs 功能具有抑制作用。ZHU 等［19］在研究缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡時發(fā)現(xiàn)，miRNA-503 可靶向作用于IGF-1R。因此，IGF-1R 可能是miRNA-503 下游靶基因，本文結(jié)果也顯示miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染可促進IGF-1R的表達，間接證實了這一結(jié)論。

綜上所述，卵巢早衰患者血漿中miRNA-503高表達，與EPCs 數(shù)量減少及卵巢動脈血流動力學(xué)減退相關(guān)。miRNA-503 在卵巢早衰EPCs 中高表達，miRNA-503 inhibitor 轉(zhuǎn)染后可增強EPCs 增殖和黏附能力，可能與IGR-1R 表達上調(diào)有關(guān)。