高血壓腎損害患者IL-6-572、IL-6-174基因多態(tài)性及其與貝那普利治療反應(yīng)的相關(guān)性

于欣 張德凱 楚元奎 張怡清 白靜 邢譯文 楊震

1寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系（銀川750004）；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心（銀川750004）

高血壓腎病的主要病理學(xué)改變?yōu)檠装Y、腎小球硬化和間質(zhì)纖維化［1］。免疫細胞，尤其是單核/巨噬細胞發(fā)揮重要作用［2-3］。有研究［4-7］表明高血壓腎損害與免疫炎癥相關(guān)。本團隊先前的研究顯示高血壓腎損害患者血清腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）水平升高［8］，提示炎癥因子和炎癥反應(yīng)在其中扮演重要角色。

既已知炎癥和免疫在高血壓腎損害中發(fā)揮重要作用，而細胞因子IL-6是炎癥和免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)，受IL-6 基因多態(tài)性的調(diào)控，其中IL-6-572 和IL-6-174 基因是調(diào)控的重要位點，那么高血壓腎損害的發(fā)生是否與IL-6-572和IL-6-174的基因多態(tài)性相關(guān)目前鮮有研究。本研究探討高血壓腎損害與IL-6-572、IL-6-174 基因型的關(guān)聯(lián)，及其不同基因型對貝那普利治療的反應(yīng)，擬通過IL-6基因多態(tài)性檢測篩選高血壓腎損害的高危人群，并為高血壓腎損害患者精準選擇降壓藥物提供指導(dǎo)。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2013年1月至2015年12月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的初診高血壓患者284 例，其中男170 例，女114 例，平均年齡（52 ± 11）歲。測定24 h 尿蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER），分為高血壓組（UAER ＜20 μg/min）和高血壓腎損害組（UAER ≥20 μg/min）。高血壓診斷標準：收縮壓（systolic blood pressure，SBP）≥140 mmHg 和（或）舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）≥90 mmHg。高血壓腎損害診斷標準：高血壓病史合并UAER ≥20 μg/min，除外慢性腎小球腎病（有腎小球疾病史，可以伴發(fā)高血壓，但常于腎損害后發(fā)生）和糖尿病腎?。ㄏ扔刑悄虿∈?，后出現(xiàn)腎損害）等腎臟疾病。排除標準：有繼發(fā)性高血壓，以及合并感染、腫瘤、肝病、代謝及免疫等相關(guān)疾病的患者。同時選取160 健康體檢者作為正常血壓組，其中男94例，女66例，平均年齡（52±12）歲。貝那普利作為高血壓腎損害患者的基礎(chǔ)降壓藥物，10 mg，1 次/d，依據(jù)血壓水平及臨床特點酌情加用鈣拮抗劑（calcium channel blockers，CCBs）、β 阻滯劑（β blockers）、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（angiotensin Ⅱreceptor blockers，ARBs）、利尿劑。16 周后復(fù)查IL-6 及UAER 評價療效。

1.2 UAER 測定留取24 h 尿（7：00-次日7：00），混勻后取5 mL 離心，取上清液用放免法測定尿白蛋白，計算UAER（μg/min）。間隔1 周以上重復(fù)測定一次，取均值作為最后結(jié)果。

1.3 血液標本的采集空腹8 h 后清晨取靜脈血于抗凝管中離心，取血漿檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）和IL-6。取白細胞層加入紅細胞裂解液，白細胞沉淀行DNA 提取。IL-6 濃度采用酶聯(lián)免疫檢測法（美國RB 公司）。

1.4 基因多態(tài)性檢測制備DNA 模板后采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）檢測。引物序列：IL-6-572：上游5′-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3′，下游5′-GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCAG-3′。IL-6-174：上游5′-TGACTTCAGCTTTACTCTTTGT-3′，下游5′-CTGATTGGAAACCTTATTAAG-3′。PCR 擴增體系：預(yù)變性94 ℃3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸200 s，35 次循環(huán)，完成后于72 ℃延伸5 min。擴增片段長度分別為163 和198 bp。然后以2%瓊脂糖凝膠進行水平電泳，然后行BsrBⅠ和NlaⅢ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 13.0 進行分析，計量資料以（）表示，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比（%）表示。Hardy-Weinberg 平衡法檢測樣本的群體代表性。多組間比較采用方差分析。計數(shù)資料的比較及各基因型頻率分布和等位基因頻率分布的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料3 組間年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、TG 比較無差異（P＞0.05）。高血壓組和高血壓腎損害組SBP、DBP、TC、LDL-C和IL-6 均高于正常血壓組（P＜0.05）。高血壓組和高血壓腎損害組間比較，高血壓腎損害組IL-6高于高血壓組（P＜0.05），其余指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組間一般指標比較Tab.1 The basic parameters in difference groups ±s

表1 各組間一般指標比較Tab.1 The basic parameters in difference groups ±s

注：與正常血壓組比較，aP ＜0.05；與高血壓組比較，bP ＜0.05

組別正常血壓組高血壓組高血壓腎損害組P值例數(shù)160 152 132年齡（歲）52±12 53±10 51±11 0.385男/女（例）94/66 90/62 80/52 0.947 BMI（kg/m2）22±5 25±6 23±5 0.645 SBP（mmHg）124±12 155±18a 154±15a＜0.001 DBP（mmHg）81±9 98±10a 97±11a＜0.001 TC（mmol/L）3.76±1.13 5.34±1.01a 5.49±0.99a＜0.001 TG（mmol/L）1.86±0.88 1.96±1.15 1.99±0.92 0.865 LDL-C（mmol/L）2.03±0.65 2.97±0.98a 3.04±0.87a＜0.001 IL-6（ng/L）234±45 354±52a 436±65ab＜0.001

2.2 IL-6-572 和IL-6-174 基因多態(tài)性分布3 組的IL-6-572 基因型頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。高血壓腎損害組中，CG 和GC 分別是IL-6-572 和IL-6-174 占比最高的基因型。3 組間IL-6-572G/C 和IL-6-174C/G 等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 高血壓腎損害患者IL-6-572 和IL-6-174 不同基因型間臨床特征的比較結(jié)果顯示，IL-6-572CG基因型和IL-6-174GG 基因型患者的TC、LDL-C 及IL-6 水平最高，方差分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表2 各組間IL-6-572 和IL-6-174 基因多態(tài)性比較Tab.2 The genotypes of IL-6-572 and IL-6-174 in different groups 例（%）

2.4 高血壓腎損害患者不同IL-6-572和IL-6-174基因型對貝那普利治療的反應(yīng)IL-6-572 和IL-6-174 3 種基因型間在降壓藥物的應(yīng)用方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療16 周后復(fù)測UAER 和IL-6結(jié)果顯示，IL-6-572 GG 基因型、IL-6-174 CC 基因型治療后反應(yīng)最佳，治療前后UAER 和IL-6的改變幅度最大（P＜0.05）。而方差分析顯示3 組間血壓下降幅度差異無顯著性（P＞0.05），見表4、5。

3 討論

IL-6-572 和IL-6-174 基因都位于IL-6 基因啟動子區(qū)域。BRULL 等［9］研究表明，L-6 啟動子-572C/G 多態(tài)性是IL-6 基因調(diào)控的關(guān)鍵點，而IL-174 基因與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）相關(guān)［10］。IL-6-572 基因型變化可能影響其轉(zhuǎn)錄活性和在外周血中的表達。有研究［11］表明IL-6-572、IL-6-174 基因多態(tài)性與風濕性心臟病相關(guān)，張文靜等［12］研究發(fā)現(xiàn)IL-6-572C/G 位點基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）易感性有關(guān)聯(lián)，而COPD 患者IL-6 水平顯著升高［13］。但目前少有研究探索IL-6-572、IL-6-174 多態(tài)性與高血壓及高血壓腎損害之間的關(guān)聯(lián)。

表3 高血壓腎損害患者IL-6-572、IL-6-174 各基因型的臨床特征比較Tab.3 The clinical characteristics of the hypertensive renal damage subsets with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes±s

表3 高血壓腎損害患者IL-6-572、IL-6-174 各基因型的臨床特征比較Tab.3 The clinical characteristics of the hypertensive renal damage subsets with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes±s

注：與IL-6-572CG 基因型比較，aP ＜0.05；與IL-6-572CC 基因型比較，bP ＜0.05；與IL-6-174GG 基因型比較，cP ＜0.05；與IL-6-174GC 基因型相比較，dP ＜0.05

例數(shù)年齡（歲）BMI（kg/m2）SBP（mmHg）DBP（mmHg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）IL-6（ng/L）IL-6-572 CG 70 51±12 24±5 154±14 95±10 6.12±1.09 2.02±0.89 3.83±0.70 533±76 CC 42 50±10 23±6 156±13 97±10 5.11±0.97a 2.15±0.96 2.74±0.71a 421±66a GG 20 53±12 25±4 153±15 96±11 4.59±0.87ab 2.14±1.07 2.37±0.64ac 391±50ab P 值0.145 0.369 0.586 0.254 0.000 0.547＜0.001＜0.001 IL-6-174 GG 68 52±11 23±5 152±13 96±10 6.10±1.10 2.00±1.00 3.40±0.82 531±75 GC 44 51±10 21±6 150±15 94±11 5.14±0.98c 2.02±0.92 2.74±0.95c 423±68c CC 20 54±12 24±4 156±15 99±11 4.76±0.97cd 2.16±1.10 2.67±0.65cd 387±54cd P 值0.672 0.624 0.341 0.273 0.033 0.435 0.041 0.015

表4 高血壓腎損害組IL-6-572、IL-6-174 各基因型服用降壓藥物比較Tab.4 The antihypertensive drugs in hypertensive renal damage patients with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes 例（%）

本研究發(fā)現(xiàn)，單純高血壓患者和高血壓腎損害患者相比，IL-6-174、IL-572的基因型存在差異，而不同基因型之間IL-6的濃度水平也存在差異，這種基因多態(tài)性使得不同患者在相同的血壓水平，IL-6的濃度水平可能不同，對腎臟產(chǎn)生不同程度的影響［14］。

表5 高血壓腎損害不同IL-6-572、IL-6-174 各基因型對貝那普利的反應(yīng)Tab.5 The therapeutic responses to benazepril in hyertensive renal damage subsets with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes±s

表5 高血壓腎損害不同IL-6-572、IL-6-174 各基因型對貝那普利的反應(yīng)Tab.5 The therapeutic responses to benazepril in hyertensive renal damage subsets with different IL-6-572 and IL-6-174 genotypes±s

注：與IL-6-572CG 基因型比較，aP ＜0.05；與IL-6-572CC 基因型比較，bP＜0.05；與IL-6-174GG 基因型比較，cP ＜0.05；與IL-6-174GC 基因型相比較，dP ＜0.05

例數(shù)△SBP（mmHg）△DBP（mmHg）△UAER（μg/min）△IL-6（ng/L）IL-6-572 CG 70 24±9 18±12 39±36 81±62 CC 42 28±10 21±10 73±34a 138±66a GG 20 25±13 20±11 108±48ab 220±106ab P 值0.234 0.146 0.000 0.000 IL-6-174 GG 68 25±10 19±10 41±38 77±65 GC 44 31±12 22±12 78±67c 143±76c CC 20 29±13 20±10 112±98cd 223±126cd P 值0.346 0.158＜0.001＜0.001

炎癥和免疫，尤其是細胞因子IL-6 在高血壓腎損害中的作用在近年來得到越來越多的研究證實［15］。在慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）患者的腎組織中，IL-6 濃度升高，如果患者伴有顯著的血壓升高，那么IL-6的升高更為顯著。本課題組前期研究顯示高血壓腎損害患者IL-6 升高［8］，表明高血壓腎損害時，IL-6 在腎內(nèi)和外周都升高。而另外的研究［15］發(fā)現(xiàn)鹽敏感性大鼠的高血壓腎損害在經(jīng)過IL-6的特異性中和抗體干預(yù)處理后，能夠得到顯著減輕，從側(cè)面證實了IL-6 在高血壓腎損害中的作用。

IL-6的腎損害作用與血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，Ang Ⅱ）密切相關(guān)。作為AngⅡ信號傳遞過程中的重要因子，IL-6 在AngⅡ介導(dǎo)的纖維化相關(guān)基因和原內(nèi)皮素-1（prepro-ET-1）mRNA 在腎臟的表達中發(fā)揮著重要作用，而這兩種基因的過度表達能夠誘導(dǎo)腎纖維化和腎損害。小鼠實驗中，經(jīng)過AngⅡ灌注處理后，IL-6 水平升高，如敲除IL-6基因，則血壓顯著下降，且由AngⅡ介導(dǎo)的腎損害和腎纖維化也會明顯減輕，提示IL-6 是高血壓和高血壓腎損害的重要介質(zhì)［15］。

本研究結(jié)果還顯示，兩個病例組的TC和LDL-C水平都較正常對照組升高。在高血壓腎損害組內(nèi)，IL-6-572、IL-6-174 不同基因型的TC 和LDL-C水平不同，不同基因型的IL-6 水平也存在差異，提示TC 和LDL-C 可能與IL-6 之間有著某種關(guān)聯(lián)，但這種關(guān)聯(lián)的機制目前報道較少。

已知高血壓腎損害的發(fā)生與IL-6 基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)，不但可以檢測IL-6 基因型來評估高血壓患者發(fā)生腎損害的風險，而且在選擇藥物時，可以根據(jù)IL-6 基因型在高?；颊咧袃?yōu)先選擇有腎臟保護作用的降壓藥，如貝那普利等，以期延緩高血壓腎損害的進展。

另外，本研究還探討了高血壓腎損害患者IL-6 各基因型對貝那普利的反應(yīng)。通過檢測治療后UAER 和IL-6 水平的變化，發(fā)現(xiàn)對貝那普利的療效與IL-6 基因型相關(guān)，檢測IL-6-572 和IL-6-174基因型可預(yù)測高血壓腎損害患者對貝那普利的療效，對藥物的合理篩選具有指導(dǎo)作用。

本研究的新穎之處在于揭示了IL-6-572 和IL-6-174 基因多態(tài)性與高血壓腎損害及其與貝那普利治療反應(yīng)的關(guān)聯(lián)，不足之處在于研究對象的范圍較為局限，對慢性腎病和估算腎小球濾過率（eGFR）＜60 mL/（min·1.73 m2）的患者的腎功能損害與IL-6-572 和IL-6-174 基因多態(tài)性的相關(guān)性未能進行探討，這也是下一步研究的方向。