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    細胞(蠟)塊聯(lián)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)通過胸腔積液檢測診斷惡性腫瘤的價值

    2019-09-19 01:51:54王占東繆曉丹
    實用醫(yī)藥雜志 2019年9期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)移性細胞學(xué)涂片

    王占東,卓 靜,李 菲,繆曉丹,王 濤,時 瑤

    胸腔積液是晚期惡性腫瘤患者常見的臨床并發(fā)癥狀,臨床多采用穿刺抽取積液以減輕癥狀,并進行常規(guī)細胞學(xué)檢查。大多數(shù)病例會得到明確診斷,但對于原發(fā)灶不明、無法通過內(nèi)鏡活檢、體外穿刺及手術(shù)切除獲得組織標本的病例,胸腔積液細胞病理學(xué)診斷可能是這類患者能確診的選擇方法。傳統(tǒng)涂片明顯不能滿足要求,臨床迫切需要從胸腔積液獲得明確診斷,采取精準治療,因此胸腔積液進行細胞蠟塊結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測應(yīng)運而生,并迅速發(fā)展,筆者收集近兩年的病例,進行回顧性總結(jié)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料收集2017年1月—2018年12月徐州市腫瘤醫(yī)院收治的406例胸腔積液患者作為觀察對象,所有患者均經(jīng)過該院影像學(xué)診斷、穿刺確診為胸腔積液患者;所有患者均進行傳統(tǒng)涂片細胞學(xué)檢查,其中陰性161例、僅見少許異型細胞38例,高度可疑癌36例,發(fā)現(xiàn)癌細胞164例,其他惡性腫瘤7例。其中56例診斷不明確或已診斷為癌而臨床需要進一步分型的患者,進行細胞蠟塊及免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測。

    1.2方法

    1.2.1傳統(tǒng)涂片制作方法 采集患者漿膜腔積液標本 200~500 ml,迅速送往細胞室。 取出 20 ml,置離心管中,2000 r/min,離心10 min,棄去上清,取出沉渣,采用推拉法制片2張/例,待其自然風干之后,使用瑞特-吉姆薩雙染色法進行染色處理。

    1.2.2細胞塊制作方法 把剩余的漿膜腔積液,靜止后,棄上清,留存50 ml,震蕩后移入離心管內(nèi),2000 r/min,離心10 min離心兩次后離心管中加入10%中性甲醛10 ml,室溫固定處理1 h后,棄上清,使用吸管將細胞塊放置于顯微鏡擦鏡紙上,包好后放入包埋盒,置于自動脫水機中進行處理,做成石蠟細胞塊。進行常規(guī)石蠟包埋切片,蘇木素-伊紅染色,光鏡觀察。

    1.2.3免疫細胞化學(xué)采用En Vision法 一抗雌激素受體廣譜細胞角蛋白 (pan-cytokeratin,CKpan)、CK5/6、P63、GATA3、Cg-A、Synaptophysin、TTF-1、NapsinA、Calretin、WT-1、MOC-31、BerEP4、Ki-67等均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。陽性判斷標準:相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒。操作步驟均按說明書進行。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),率采用(%)表示,比較用 χ2檢驗。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    56例胸腔積液患者,男18例,女38例;年齡25~86歲,中位年齡69歲。傳統(tǒng)涂片法查見癌細胞,即陽性37例;未查見癌細胞,即陰性5例;查見異型或可疑癌細胞,即不確定14例。胸腔積液細胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,陽性47例(包括轉(zhuǎn)移性肺腺癌43例,鱗狀細胞癌2例,乳腺癌1例,卵巢漿液性癌1例),陰性9例。其中2例傳統(tǒng)涂片診斷為癌,而細胞塊加免疫細胞化學(xué)證實為增生的間皮細胞,14例不確定者,其中9例證實為癌,5例為陰性。后者陽性檢出率高于前者,且不確定構(gòu)成比低于前者(表1)。兩種方法檢出率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.556,P<0.05),見表 2。

    細胞塊石蠟切片中轉(zhuǎn)移性肺腺癌細胞常常成團聚集,邊緣光滑的三維立體的細胞球最常見,也可以呈梅花狀、乳頭狀和腺腔,核漿比增大,核異型,核染色質(zhì)細膩(圖1),背景可見少許炎細胞,使癌細胞非常突出,或背景夾雜大量增生間皮細胞,與癌細胞不易區(qū)別(圖2)。造成形態(tài)學(xué)診斷困難。

    表 1 傳統(tǒng)涂片與細胞塊+免疫細胞化學(xué)檢出率比較[例(%)]

    表 2 兩種方法檢出率與漏檢率比較[例(%)]

    免疫細胞化學(xué)染色:轉(zhuǎn)移性癌表達廣譜細胞角蛋白(pan-cytokeratin,CKpan)、BerEP4,同時轉(zhuǎn)移性肺腺癌細胞 TTF-1(圖 3)、NapsinA(圖 4)陽性;鱗狀細胞癌 CK5/6、P40陽性;乳腺癌 ER、PR及GATA3 陽性;卵巢癌 WT-1、PAX8、CA125 陽性。而增生的間皮細胞表達 CK5/6、Calretin、WT-1等抗體。

    圖1~4見封三。

    3 討論

    胸腔積液是臨床常見病癥,其良惡性判定對疾病的診斷、治療及預(yù)后有重要的臨床意義。如何利用胸腔積液判斷是炎癥反應(yīng)、間皮增生、間皮瘤、還是轉(zhuǎn)移性腫瘤,是臨床關(guān)心的問題,如果能同時判斷轉(zhuǎn)移性腫瘤的來源及類型,亦是臨床診斷及治療的需要。胸腔積液離心后制成細胞涂片,進行細胞學(xué)診斷是最常用的方法,已開展多年,也解決了很多實際問題,但尚不能滿足需要,免疫組織化學(xué)是外科組織病理學(xué)最常用的診斷技術(shù),其結(jié)果有助于確診腫瘤的良惡性、組織來源及組織亞型。如何把免疫組織化學(xué)應(yīng)用于細胞學(xué),現(xiàn)在有多種方法,其一是細胞涂片退染后,免疫細胞化學(xué)染色;其二采用同時制備多張涂片進行免疫細胞化學(xué)染色的方式;還有一種就是現(xiàn)在逐漸被認可并用于實際工作的細胞塊加免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法[1-3]。

    細胞塊(cell block,CB)制備是指將細胞懸浮液離心,得到高度濃縮的細胞和微小的組織塊,再經(jīng)由固定、脫水、透蠟和石蠟包埋等操作后得到的可長期保存的細胞蠟塊?,F(xiàn)在常見的細胞塊制備方法主要有直接法(離心管沉淀制備法、冷凍細胞團蠟塊制備法、試管包埋法、載玻片細胞聚集制備法)和間接法(瓊脂細胞塊制備法、蛋清細胞塊制備法、凝血酶一血漿細胞塊制備法、HistoGel制備法、Collodion bag(ColB)制備法)[4],筆者采用了最簡單直接的離心沉淀法,富集有核細胞層制備細胞塊,具有細胞數(shù)量較多,背景清晰,染色鮮艷,核漿對比清晰,組織結(jié)構(gòu)也保存得比較完整等優(yōu)點[5]。同時細胞塊易于保存,可連續(xù)切片,便于進行免疫細胞化學(xué)染色,其免疫細胞化學(xué)染色背景清晰,著色均勻,陽性定位準確,顯色明確,資料可長期保存,使細胞學(xué)具有組織病理學(xué)的特點[6]。如有需要還可以進行基因檢測[7]。

    胸腔積液需要確定是炎癥反應(yīng),間皮瘤,還是轉(zhuǎn)移性腫瘤,因此需要一組標志物,進行鑒別診斷,常 用 的 是 CK (pan)、CK5/6、P63、GATA3、Cg-A、Synaptophysin、TTF -1、NapsinA、Calretin、WT -1、MOC-31、BerEP4、Ki-67等多種抗體標志。對于胸腔積液中常見的轉(zhuǎn)移性肺腺癌CK (pan)、TTF-1、NapsinA 是常用的標志物[8],鱗狀細胞癌 CK5/6、P40陽性;乳腺癌ER、PR及GATA3陽性;卵巢癌WT-1、PAX8、CA125陽性。而增生的間皮細胞表達CK5/6、Calretin、WT-1 等 抗 體 。 其 中 WT-1(Wilm’s tumor gene)在增生間皮細胞、間皮瘤及轉(zhuǎn)移性卵巢漿液性癌中呈核陽性,轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤胞漿陽性。而組織細胞、淋巴細胞、轉(zhuǎn)移性肺腺癌、乳腺癌、胃癌等呈陰性[9]。CK(pan)在間皮與癌細胞均有表達,需要 Calretin、WT-1、MOC-31、BerEP4 等多種抗體聯(lián)合應(yīng)用,才能鑒別診斷。該組病例,未見報道中的惡性黑色素瘤,淋巴瘤,如有需要,應(yīng)用于組織蠟塊的免疫細胞化學(xué)抗體,在細胞塊中也適用。

    該實驗結(jié)果顯示,細胞塊結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法對于胸腔積液的陽性檢出率明顯高于傳統(tǒng)涂片,且對于轉(zhuǎn)移癌能進一步明確來源及類型,細胞塊具有可長期保存的優(yōu)勢,因此細胞塊結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法對于提高細胞學(xué)診斷準確性有很大幫助,應(yīng)用于宮頸及非婦科液基細胞學(xué)的細胞塊結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法已有報道[10],不斷總結(jié)經(jīng)驗,提高細胞學(xué)診斷水平。

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