集胞藻缺氮馴化株的代謝組學(xué)分析

胡 浪，劉燁蓉，許偉釗，王 璐，胡章立，王江新，雷安平

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060

實(shí)驗(yàn)室馴化是指生物為適應(yīng)人工環(huán)境而改變其遺傳性狀的過(guò)程[1].實(shí)驗(yàn)室馴化可被用來(lái)獲得特殊的突變體，例如，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室馴化，成功獲得了丁醇耐受的藍(lán)藻[2].另一方面，由于實(shí)驗(yàn)室條件可控，實(shí)驗(yàn)室馴化可以用來(lái)研究一些不適合在野外和其他復(fù)雜環(huán)境中研究的問(wèn)題，如生物的“雙面下注”策略[3]和適合度的動(dòng)態(tài)變化[4].“雙面下注”是高等生物在逆境條件下常采用的一種應(yīng)對(duì)策略，它是指當(dāng)存在滅種風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，高等生物不會(huì)將種群延續(xù)的希望全寄托于某一特定類(lèi)型的后代，而是將希望寄托于多種不同類(lèi)型的后代[5].例如，一年生植物會(huì)產(chǎn)生推遲發(fā)芽和立即發(fā)芽?jī)煞N不同類(lèi)型的種子，立即發(fā)芽的種子能更快形成植株，而推遲發(fā)芽的種子則可以幫助植物順利度過(guò)逆境時(shí)期[5].藍(lán)藻是一類(lèi)古老的原核生物，但它們能以類(lèi)似于高等植物光合作用的方式固定二氧化碳[6]，這類(lèi)原核生物在受到脅迫時(shí)是否也會(huì)使用“雙面下注”的策略來(lái)確保種群的延續(xù)，目前尚不清楚.

藍(lán)藻可分為固氮藍(lán)藻和非固氮藍(lán)藻.氮元素是核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的組成元素，它調(diào)控光合作用、生長(zhǎng)與發(fā)育等多種生命過(guò)程，被稱(chēng)為生命元素[7-8].缺氮會(huì)影響農(nóng)作物產(chǎn)量[9]，研究長(zhǎng)期缺氮脅迫對(duì)生物代謝的影響，對(duì)解析缺氮條件下的生物適應(yīng)機(jī)制、開(kāi)發(fā)氮利用率高的農(nóng)作物具有重要意義.在受到缺氮脅迫時(shí)，固氮藍(lán)藻可利用空氣中的氮?dú)鈦?lái)緩解缺氮環(huán)境帶來(lái)的壓力[10]，因此，在研究缺氮脅迫對(duì)生物代謝的影響時(shí)，固氮藍(lán)藻不能用作研究材料.非固氮藍(lán)藻不能利用空氣中的氮?dú)猓荒芾铆h(huán)境中的化合態(tài)氮，集胞藻Synechocystissp. PCC6803是非固氮藍(lán)藻的模式生物，具有易于培養(yǎng)、繁殖快、遺傳背景清晰、遺傳操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[11-12]，是研究缺氮對(duì)生物代謝影響的適宜材料[13].然而，尚未見(jiàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室馴化來(lái)獲得能夠耐受缺氮脅迫的集胞藻的報(bào)道.

代謝組可以提供有關(guān)生物代謝網(wǎng)絡(luò)的信息.由于細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)的速率直接受代謝物濃度的調(diào)控，代謝組被認(rèn)為比其他組學(xué)更能反映生物的生理變化[14].氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)可以同時(shí)檢測(cè)氨基酸、脂肪酸和糖類(lèi)等多種小分子，具有靈敏性高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)[15]，常用于代謝組的檢測(cè). WANG等[14]利用GC-MS分析了多個(gè)Synechocystissp. PCC6803鹽敏感突變體的代謝組，并成功鑒定了每個(gè)突變體的特異代謝模塊，表明GC-MS能夠用于解析藍(lán)藻代謝組的變化.

本研究以非固氮藍(lán)藻集胞藻Synechocystissp. PCC6803為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)長(zhǎng)達(dá)615 d的缺氮實(shí)驗(yàn)室馴化獲得了8株缺氮馴化株.用GC-MS檢測(cè)這些馴化株的代謝組，分析它們的代謝模式，以此探究藍(lán)藻在缺氮條件下的進(jìn)化規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 藻株與培養(yǎng)條件

集胞藻Synechocystissp. PCC6803由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)提供.培養(yǎng)溫度為30 ℃，光照強(qiáng)度為30 μmol/(m2s)，光暗周期比為12 h∶12 h，正常培養(yǎng)時(shí)選用BG11培養(yǎng)基(培養(yǎng)基含1.5 g/L NaNO3)[16]，缺氮培養(yǎng)選用1/3 N BG11培養(yǎng)基(NaNO3的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.5 g/L)或1/20 N BG11培養(yǎng)基(NaNO3的質(zhì)量濃度調(diào)整為0.075 g/L)，無(wú)氮培養(yǎng)時(shí)選用-N BG11培養(yǎng)基(不含NaNO3).

1.2 缺氮條件下的實(shí)驗(yàn)室馴化

從野生型Synechocystissp. PCC6803固體平板上隨機(jī)挑選1個(gè)單克隆，將其接種到液體BG11培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將培養(yǎng)物分為9份，分別轉(zhuǎn)移到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)孔的體積為3 mL，其中8個(gè)作為缺氮馴化株，1個(gè)作為對(duì)照株. 缺氮馴化株和對(duì)照株來(lái)源于同一個(gè)單克隆，遺傳背景相同.缺氮馴化株采用-N BG11培養(yǎng)基和1/3 N BG11培養(yǎng)基交替培養(yǎng).培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，730 nm處的光密度D(730)=0.05. 細(xì)胞先在-N BG11培養(yǎng)基中缺氮脅迫9 d，離心收集后轉(zhuǎn)入1/3 N BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d，如此反復(fù).對(duì)照株始終用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接時(shí)間與缺氮馴化株一致.每次轉(zhuǎn)接后取部分樣品鏡檢并用10%的二甲基亞砜?jī)龃姹７N，若發(fā)現(xiàn)污染則舍棄所有當(dāng)前批次樣品，隨后的馴化實(shí)驗(yàn)以最近一次保種的未受污染的樣品繼續(xù)進(jìn)行.

1.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)和比生長(zhǎng)速率

培養(yǎng)時(shí)每?jī)商鞙y(cè)定一次培養(yǎng)物的D(730)， 靜置培養(yǎng)至平臺(tái)期并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn).生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù).比生長(zhǎng)速率的計(jì)算公式[17]為

(1)

其中，t2和t1為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的兩個(gè)給定的時(shí)間點(diǎn)；N2和N1為t1和t2對(duì)應(yīng)的D(730)， 用lnN與t作線(xiàn)性回歸分析，回歸直線(xiàn)的斜率即為比生長(zhǎng)速率.

1.4 基于氣相色譜-質(zhì)譜的代謝組檢測(cè)

將對(duì)照株和馴化株接種到1/3 N BG 11中，起始D(730)為0.05，培養(yǎng)12 d后顯微計(jì)數(shù)，取1×108個(gè)細(xì)胞提取代謝組，用GC-MS對(duì)代謝組進(jìn)行檢測(cè).實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù).代謝組的提取方法及GC-MS的檢測(cè)條件參考文獻(xiàn)[18].細(xì)胞經(jīng)4 ℃、8 000 g離心收集，用雙蒸水洗滌3次，加入1 mLV(甲醇)∶V(氯仿)∶V(水)=10∶3∶1的混合液，反復(fù)凍融5次后4 ℃、 15 000 g 離心3 min，收集上清液.取200 μL上清液與20 μL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氘標(biāo)記的琥珀酸(氘標(biāo)記的琥珀酸用作GC-MS檢測(cè)時(shí)的內(nèi)標(biāo))混合，旋轉(zhuǎn)真空干燥儀干燥后將沉淀溶于20 μL質(zhì)量濃度為20 mg /mL的甲氧基胺鹽酸鹽，30 ℃孵育90 min后加入90 μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺，37 ℃孵育30 min，最后4 ℃、15 000 g離心3 min得到衍生化的代謝物.衍生化的代謝物用配有HP-5MS毛細(xì)管柱(30m×250 mm)的7890A-MSD5975C系統(tǒng)檢測(cè).樣品在230 ℃、無(wú)分流模式下進(jìn)樣.載氣為氦氣，流速控制在1 mL/min.毛細(xì)管柱首先在45 ℃恒溫2 min，后升溫至280 ℃，升溫速率為5 ℃/min，最后280 ℃恒溫2 min.采用自動(dòng)質(zhì)譜處理識(shí)別系統(tǒng)(automated mass spectral deconvolution identification system, AMDIS)對(duì)質(zhì)譜峰進(jìn)行分析.通過(guò)將數(shù)據(jù)與美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所(national institute of standards and technology, NIST)的質(zhì)譜庫(kù)比對(duì)，來(lái)對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，最后去除匹配質(zhì)量低(得分小于70)的化合物.本研究使用的代謝物分析為相對(duì)定量分析，代謝物的響應(yīng)面積與內(nèi)標(biāo)(氘標(biāo)記的琥珀酸)的響應(yīng)面積的比值為代謝物的相對(duì)響應(yīng)面積.

1.5 分層聚類(lèi)分析

根據(jù)樣品的代謝組用歐氏距離計(jì)算樣品間的鄰近矩陣，使用組間連鎖的方法對(duì)樣品進(jìn)行分層聚類(lèi)，分層聚類(lèi)由SPSS20.0軟件完成.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Leveve法作方差齊性檢驗(yàn)，采用SPSS20.0軟件對(duì)樣品的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行單因素方差分析(one-way analysis of variance, One-way ANOVA)，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法.

圖1 集胞藻Synechocystis sp. PCC6803在不同氮濃度培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curves of Synechocystis sp. PCC6803 in mediums with different nitrogen concentrations

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 實(shí)驗(yàn)室馴化氮濃度的選擇

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室馴化之前，需要確定合適的氮濃度來(lái)進(jìn)行馴化.野生型Synechocystissp. PCC6803在BG11培養(yǎng)基、1/3 N BG11培養(yǎng)基、1/20 N BG11培養(yǎng)基和-N BG11培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1.用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)Synechocystissp. PCC6803時(shí)，D(730)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，到12 d 時(shí)D(730)達(dá)到(1.76±0.06).當(dāng)用1/20 N BG11培養(yǎng)基和-N BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，D(730)不隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明Synechocystissp. PCC6803不能在這兩種培養(yǎng)基中生長(zhǎng).當(dāng)用1/3 N BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)Synechocystissp. PCC6803時(shí)，D(730)也隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但增加幅度小于用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng).用1/3 N BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d 時(shí)，D(730)僅為(1.27±0.13)，表明在1/3 N BG11培養(yǎng)基中，Synechocystissp. PCC6803能夠生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)受到抑制.為保證實(shí)驗(yàn)室馴化中Synechocystissp. PCC6803既能生長(zhǎng)，又受到缺氮抑制，本研究選用1/3 N BG11培養(yǎng)基和-N BG11培養(yǎng)基交替培養(yǎng)藻細(xì)胞.

2.2 馴化株與對(duì)照株在缺氮脅迫條件下的生長(zhǎng)

經(jīng)過(guò)615 d的實(shí)驗(yàn)室馴化，獲得了8株缺氮馴化株(NS1～NS8)和1株對(duì)照株(CT).為研究長(zhǎng)期缺氮對(duì)集胞藻生長(zhǎng)的影響，比較了馴化株和對(duì)照株在缺氮條件下(1/3 N BG11培養(yǎng)基)的生長(zhǎng)(圖2)，對(duì)照株和馴化株在培養(yǎng)初期均沒(méi)有明顯的滯后期，它們均在第16 d達(dá)到各自的最大D(730). 圖3顯示了馴化株和對(duì)照株在1/3 N BG11培養(yǎng)基中的比生長(zhǎng)速率，樣品上方含相同字母表明樣品間比生長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異，不含相同字母表明樣品間比生長(zhǎng)速率差異顯著.對(duì)照株在1/3 N BG11培養(yǎng)基中的比生長(zhǎng)速率為0.23±0.01 /d，對(duì)照株與馴化株的比生長(zhǎng)速率差異不顯著(p>0.05). 馴化株的比生長(zhǎng)速率在(0.22～0.24)/d，其中，NS1、NS2、NS3、NS7和NS8的比生長(zhǎng)速率相對(duì)較高，NS4、NS5和NS6的比生長(zhǎng)速率相對(duì)較低.馴化株NS1、NS7和NS8的比生長(zhǎng)速率顯著高于NS4、NS5和NS6(p<0.05)， 馴化株NS6的比生長(zhǎng)速率顯著低于NS1、NS2、NS7和NS8(p<0.05)(圖3).

圖2 馴化株(NS1-NS8)和對(duì)照株(CT)在1/3 N BG11培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.2 Growth curves of nitrogen deficiency-generated strains (NS1-NS8) and control strain (CT) in 1/3 N BG11 medium

圖3 馴化株(NS1-NS8)和對(duì)照株(CT)在1/3 N BG11培養(yǎng)基中的比生長(zhǎng)速率(μ)Fig.3 Specific growth rates (μ) of nitrogen deficiency-generated strains (NS1-NS8) and control strain (CT) in 1/3 N BG11 medium

2.3 基于氣相色譜-質(zhì)譜的代謝組檢測(cè)及分層聚類(lèi)分析

為了研究長(zhǎng)期缺氮對(duì)藻株代謝組的影響，利用GC-MS對(duì)這些藻株的代謝物進(jìn)行了檢測(cè)，共鑒定到52種代謝物，主要為氨基酸、脂肪酸、糖及其衍生物(代謝物的相對(duì)響應(yīng)面積請(qǐng)掃描論文末頁(yè)右下角二維碼).對(duì)這些藻株進(jìn)行分層聚類(lèi)分析，以揭示藻株代謝組的相似性(圖4).圖4中樣品用“-”把藻株和生物學(xué)重復(fù)間隔開(kāi)，例如，CT-1代表對(duì)照株CT的第1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，NS6-2代表馴化株NS6的第2個(gè)生物學(xué)重復(fù).結(jié)果顯示樣品聚集形成3個(gè)聚類(lèi)，其中比生長(zhǎng)速率較高的馴化株NS1、NS2、NS3、NS7和NS8形成一個(gè)聚類(lèi)(A簇)，比生長(zhǎng)速率較低的馴化株NS4、NS5和NS6形成一個(gè)聚類(lèi)(B簇)，對(duì)照株形成另外一個(gè)聚類(lèi)(C簇)，這些結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)室馴化產(chǎn)生了兩種代謝模式不同的馴化株.

圖4 以代謝組為基礎(chǔ)的樣品分層聚類(lèi)Fig.4 Hierarchical cluster of samples based on their metabolic compositions

3 討 論

本次實(shí)驗(yàn)室馴化共獲得8個(gè)缺氮馴化株，所有馴化株的比生長(zhǎng)速率與對(duì)照株無(wú)顯著差異，表明長(zhǎng)期缺氮馴化不會(huì)提高Synechocystissp. PCC6803的生長(zhǎng).然而，本課題組前期用含有丁醇的培養(yǎng)基馴化Synechocystissp. PCC6803，成功獲得了丁醇耐受的馴化株[2].這兩次實(shí)驗(yàn)室馴化效果不同可能是由選擇壓力不同所致，缺氮馴化株的生長(zhǎng)沒(méi)有提高，因此不會(huì)增加營(yíng)養(yǎng)鹽的消耗，推測(cè)在營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏的環(huán)境下更有利于種群的延續(xù).

GC-MS可以檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多種代謝物[15]，因此能夠用于發(fā)現(xiàn)代謝的細(xì)微變化.本研究利用GC-MS檢測(cè)缺氮馴化株的代謝組時(shí)，共檢測(cè)到52種代謝物，本課題組前期在Synechocystissp. PCC6803鹽敏感突變株中檢測(cè)到60種代謝物[14].這兩項(xiàng)研究檢測(cè)到的代謝物數(shù)量相當(dāng)、種類(lèi)相似，可能是因?yàn)樗鼈兪褂玫膶?shí)驗(yàn)材料都是由野生型Synechocystissp. PCC6803衍生而來(lái).

用分層聚類(lèi)分析樣品代謝組相似性時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然馴化株的比生長(zhǎng)速率與對(duì)照株無(wú)顯著差異，但馴化株的代謝組卻不同于對(duì)照株，表明實(shí)驗(yàn)室馴化會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生影響.另外，比生長(zhǎng)速率較高的馴化株(NS1、NS2、NS3、NS7和NS8)的代謝組，不同于比生長(zhǎng)速率較低的馴化株(NS4、NS5和NS6)，表明實(shí)驗(yàn)室馴化最終產(chǎn)生了2種代謝模式不同的馴化株.缺氮脅迫下Synechocystissp. PCC6803形成不同代謝模式的后代，類(lèi)似于逆境條件下，一年生植物產(chǎn)生不同類(lèi)型的種子[5]，表明藍(lán)藻這類(lèi)原核生物在受到脅迫時(shí)，也會(huì)使用“雙面下注”的策略來(lái)確保種群的延續(xù).野生型Escherichiacoli不能利用檸檬酸只能利用葡萄糖，與此類(lèi)似，BLOUNT等[19]用缺乏葡萄糖但富含檸檬酸的培養(yǎng)基馴化E.coli， 最終也獲得了兩種不同代謝模式的馴化株(一種能高效利用葡萄糖，另外一種能利用檸檬酸).

本課題組曾經(jīng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)缺氮脅迫會(huì)增加Synechocystissp. PCC6803細(xì)胞間基因表達(dá)的差異[20]，推測(cè)在實(shí)驗(yàn)室馴化過(guò)程中，長(zhǎng)期缺氮提高了細(xì)胞間基因表達(dá)的差異，最終產(chǎn)生了兩種不同代謝模式的馴化株.解析不同代謝模式的遺傳基礎(chǔ)，則需進(jìn)一步對(duì)馴化株進(jìn)行基因組重測(cè)序，以便發(fā)現(xiàn)基因組層面上的差異[21]；另外，缺氮脅迫會(huì)影響Synechocystissp. PCC6803的DNA甲基化修飾模式，利用DNA甲基化測(cè)序技術(shù)來(lái)探究馴化株的表觀修飾變化也很有必要[22].

結(jié) 語(yǔ)

本研究表明Synechocystissp. PCC6803在應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期的缺氮脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同代謝模式的后代，以此來(lái)增加種群延續(xù)的可能，該結(jié)果有助于增加對(duì)藍(lán)藻缺氮脅迫下適應(yīng)機(jī)制的理解.